枯草芽孢桿菌B26生產多隔鐮孢霉抑制物工藝優化

張麗珍，耿海峰，樊晶晶，牛 偉，紀 春，趙婷婷， 牛 宇

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；3.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006；4.山西省農業科學研究院，山西 太原 030006；5.山西省農業科學院農業資源綜合考察研究所，山西 太原 030006)

枯草芽孢桿菌B26生產多隔鐮孢霉抑制物工藝優化

張麗珍1，耿海峰2，樊晶晶3，牛 偉4，紀 春3，趙婷婷2， 牛 宇5

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；3.山西大學生物技術研究所，山西 太原 030006；4.山西省農業科學研究院，山西 太原 030006；5.山西省農業科學院農業資源綜合考察研究所，山西 太原 030006)

采用正交試驗設計對枯草芽孢桿菌B26抑制多隔鐮孢霉培養基配方及用量進行優化，單因素試驗對B26產生活性物質的發酵條件進行選擇。以多隔鐮孢霉的抑制率為指標，B26產生拮抗效果最好的發酵培養基配方用量是：蛋白胨25g/L、淀粉45g/L 、氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。產生活性物質的最優發酵條件為：種子菌齡24h、接種量5%、初始pH7、裝液量20%、吐溫-80用量0.5%、發酵溫度30℃、轉速150r/min、發酵時間60h，獲得B26菌株發酵液對多隔鐮孢霉的抑制直徑為26mm，優于其他條件培養獲得的拮抗效果。

多隔鐮孢霉；生物防治；正交試驗；發酵條件

由多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)引起的黑斑病對采后冬棗產量和品質產生嚴重影響。應用微生物拮抗菌產生的活性物質進行水果采后病害防治是目前生物防治的一種主要方式[1-3]。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)代謝產物除具有其他微生物代謝產物所具有培養周期短，生產方便，儲藏期相對較長優點外，還具有耐熱、抗逆性強等特點，具有作為工業生防菌的優勢[4-6]。但是在實際生產中，抗菌物質的產生水平不僅取決于生

產菌種本身的性能，還與拮抗菌代謝過程中各種環境條件(包括營養條件[8-9]和培養條件[10])密切相關，即活性物質產量的多少受營養條件、p H值、溫度、通氣量、發酵時間等諸多因素影響。為了使發酵產物的生產水平達到最佳效果，通過優化菌株的發酵條件和工藝以提高菌量及抗菌物質產率是必要的。

本實驗所用枯草芽孢桿菌菌株B26為本實驗室分離、篩選、鑒定和保存的優良拮抗菌株。該菌對細交鏈格孢(Alternaria alternata)、多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick)和串珠霉(Monilia fructicola)等都有較好抑制作用，具有很好的應用前景[7]。本實驗對該菌產生拮抗活性物質的培養基及發酵條件進行優化，為下一步生物農藥開發應用提供參考，以期有效減少水果腐爛所帶來的損失。

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌B26由本實驗室分離保存。

供試病原菌：多隔鐮孢霉(Fusarium decemcellulare Brick) 由山西省農業科學院保鮮所惠贈。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯(去皮)200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、H2O 1μL；種子培養基：蛋白胨5g、酵母膏3g、葡萄糖2g、牛肉膏1g、H2O 1μL；液體發酵培養基：蛋白胨25g、淀粉40g、NaCl 1.5g、 (NH4)2SO40.8g、K2HPO41.5g、H2O 1L，pH7.0。

1.3 儀器與設備

BS-S恒溫振蕩器、HH-2數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；HH.BII.600電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療機械廠；可調式微量移液器 熱電上海儀器有限公司；YXQ-LS-50壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1FD潔凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠； TGL-16G-C高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠； 752PC紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；3-Star酸度計 美國奧立龍公司。

1.4 方法

1.4.1 發酵培養基基礎成分的正交試驗設計

試驗因素及水平見表1，淀粉及礦質元素按正交配方加入2.5%蛋白胨，pH值自然，滅菌備用。

表1 培養基成分的正交試驗的因素和水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.4.2 拮抗菌發酵液抑菌活性測定

挑取在PDA培養基上過夜活化的B26單菌落，接種到種子培養基內30℃、150r/min培養24h后，以5%的接種量接入滅菌的1～9號培養基內，設3次重復，30℃、150r/min 振蕩培養24h。采用平板涂布打孔法測定發酵液抑菌活性。將指示菌制成菌懸液(1×108CFU/mL)，吸取200μL均勻涂布于PDA平板上，待培養基表面風干后用打孔器(直徑6mm)打孔，吸取50μL菌液加入孔中，37℃下培養5d，并設置不接種的相同培養基制備的空白液為對照，觀察并記錄不同培養基配方組合下的B26菌液抑菌圈直徑和發酵菌液的光密度值(OD600nm)，通過極差分析和方差分析確定發酵培養基基礎配方。

1.4.3 不同碳源對抑菌作用的影響

分別取淀粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、乳糖、麩皮和糠皮作為液體發酵培養基成分中的碳源，制成不同碳源的發酵培養基，30℃、150r/min振蕩培養24h。

1.4.4 不同氮源對抑菌作用的影響

分別取蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨和硝酸鉀作為液體發酵培養基成分中的氮源，制成不同氮源的發酵培養基，30℃、150r/min振蕩培養24h。

1.4.5 不同初始pH值對抑菌作用的影響

用0.5mol/L鹽酸和0.5mol/L的氫氧化鈉調節液體發酵培養基初始pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。1.4.6吐溫-80的不同加入比例對抑菌作用的影響

取吐溫-80按體積分數0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%添加到液體發酵培養基中，以不加吐溫-80作對照。

1.4.7 不同培養時間對抑菌作用的影響

采用液體發酵培養基，設置6、12、24、36、48、72、84h 7個處理。

1.4.8 不同培養溫度對抑菌作用的影響

采用液體基礎培養基，設置25、30、35、40、45℃ 5個處理。

1.4.9 不同接種量對抑菌作用的影響

分別按1%、2%、5%、10%、15%、20% 6個梯度將種子培養液加入液體發酵培養基。

1.4.10 不同裝液量對抑菌作用的影響

將液體發酵培養基按照10、25、50、100、150、125、200mL 7個處理裝入250mL的三角瓶中。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

對利用不同培養基配方培養出的拮抗菌B26菌液的打孔實驗的拮抗直徑結果進行極差和方差分析，結果見表3、4。

表2 試驗結果的極差分析Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 試驗結果的方差分析Table 3 Analysis of variance for the diameter of inhibition circle with various medium components

由表3、4可知，經極差分析和方差分析獲得的結果一致，各因素主次順序均為磷酸氫二鉀＞硫酸銨＞淀粉，由此得到培養基最優配方用量：蛋白胨25g/L、淀粉45g/L、氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。以最優配方為基準進行單因子試驗，具體包括：碳源、氮源、培養時間、培養溫度、培養液的初始pH值、吐溫-80的加入量、接種量、加液量，通過比較不同培養基配方下的拮抗直徑來確定最優培養條件。

2.2 不同碳源對抑菌作用的影響

圖1 不同碳源條件下的拮抗直徑和OD600nmFig.1 Effect of carbon sources on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖1可知，當使用麥芽糖和葡萄糖為碳源時，拮抗效果較好，抑菌直徑分別達到22.5、22.3mm，同時發現使用麩皮也可以達到較好的抑制效果，抑菌直徑為21.7mm。因此在大規模生產中可以考慮以來源廣價格低的麩皮作為碳源生產拮抗菌的活性物質。

2.3 不同氮源對拮抗直徑的影響

圖2 不同氮源條件下的拮抗直徑和OD600nmFig.2 Effect of nitrogen sources on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖2可知，在不同氮源下，包括無機氮源和有機氮源，枯草芽孢桿菌B26均能生長，并產生具有拮抗活性的物質。無機氮源中，以硝酸銨為氮源的培養基拮抗效果最好，達到21.2mm；有機氮源中酵母粉的抑菌效果最好，為20.5mm。

2.4 初始pH值對抑菌作用的影響

圖3 培養基不同pH值的拮抗直徑和OD600nmFig.3 Effect of initial medium pH on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖3可知，在不同初始pH值條件下，拮抗菌的生物量不同，拮抗效果也不同：表現為隨著pH值升高，拮抗直徑逐漸變大。到pH7時最大；隨著pH值繼續升高，拮抗直徑逐漸變小，但變化幅度不大。表明枯草芽孢桿菌B26在偏酸或偏堿性條件下都能生長，但在pH7的條件下產生的拮抗活性物質對病菌拮抗直徑最大，達到21.0mm。

2.5 吐溫-80用量對抑菌作用影響

由圖4可知，吐溫-80在體積分數0.5%時，B26 OD600nm值最大，菌體濃度最高；此時B26菌液對病菌抑菌圈直徑最大。

圖4 吐溫-80不同體積分數的拮抗直徑和OD600nmFig.4 Effect of Tween -80 amount on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

2.6 培養溫度對抑菌作用的影響

圖5 不同培養溫度的拮抗直徑和OD600nmFig.5 Effect of culture temperature on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖5可知，在30℃以前，隨著溫度的升高，拮抗直徑逐漸升高(OD600nm持續到35℃，可能培養液中已產生細菌死菌體所致)，但到達30℃以后，隨著溫度的升高，拮抗直徑逐漸變小，呈梯度變小的趨勢。在30℃，雖然OD600nm不是最大的，但拮抗效果最好，拮抗直徑達到23.3mm，從而獲得拮抗菌B26的最佳發酵培養溫度為30℃。

2.7 培養時間對抑菌作用的影響

圖6 不同培養時間下的拮抗直徑和OD600nmFig.6 Effect of culture time on the production ofFusarium decemcellulareBrick inhibitor

由圖6可知，枯草芽孢桿菌B26是在60h后進入穩定期，枯草芽孢桿菌的菌體量達到最多，此時產生的拮抗活性物質較多，抑菌效果保持相應較高的水平。

2.8 接種量對抑菌作用的影響

由圖7可知，隨著枯草芽孢桿菌B26種子培養基加入量逐漸加大，拮抗直徑逐漸變大，但在加入量達到5%之后，抑菌直徑增加幅度很小(24～24.8mm)。

圖7 不同接種量的拮抗直徑和OD600nmFig.7 Antagonistic diameters and OD600nmat different inoculum sizes

2.9 裝液量對抑菌作用的影響

圖8 不同裝液量的拮抗直徑和OD600nmFig.8 Antagonistic diameters and OD600nmat different aeration rates

由圖8可知，裝液量為20%時，拮抗效果最好，拮抗直徑為22.3mm；隨著加液量的增加，過多的裝液量限制了微生物產生拮抗物質，拮抗直徑也逐漸變小。

3 結 論

3.1 通過正交試驗確定拮抗菌產生活性物質的最佳配方比例是：蛋白胨25g/L，淀粉45g/L，氯化鈉1.5g/L、硫酸銨1.0g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L。

3.2 產生活性物質的最佳發酵工藝：種子培養24h后，按照5%的接種量接入初始pH7，吐溫-80體積分數0.5%，裝液量為20%的最優液體發酵培養基內，在30℃、轉速為150r/min，發酵培養60h后獲得拮抗菌抑制多隔鐮孢霉的抑制直徑可達26mm，大于其他條件的拮抗直徑。

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Optimization of Medium Composition and Fermentation Conditions for the Production of Fusarium decemcellulare Brick Inhibitor by Bacillus subtilis B26

ZHANG Li-zhen1，GENG Hai-feng2，FANG Jing-jing3，NIU Wei4，JI Chun3，ZHAO Ting-ting2，NIU Yu5
(1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2. College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；3. Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；4. Shanxi Academy of Agricultural Sciences,Taiyuan 030006, China；5. Integrated Review Institute of Agriculture Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030006, China)

A four-factor, three-level orthogonal array design was employed to optimize four medium components for the production of Fusarium decemcellulare Brick inhibitor by Bacillus subtilis B26, and the effects of fermentation conditions on the production of Fusarium decemcellulare Brick inhibitor were explored through single factor experiments. The optimal medium composition for maximizing inhibition rate against Fusarium decemcellulare Brick was found to be composed of peptone 25 g/L, starch 45 g/L, sodium chloride 1.5 g/L, ammonium sulfate 1.0 g/L, and dipotassium hydrogen phosphate 1.5 g/L. Seed age of 24 h, inoculmum size of 5%, initial pH of 7, the volume of medium in the fermentation vessel of 20%, the amount of added Tween -80 of 0.5%, fermentation temperature of 30 ℃, rotational speed of 150 r/min and fermentation period of 60 h were found optimal. The inhibition circle diameter of the fermentation broth obtained under these conditions was 26 mm.

Fusarium decemcellulare Brick；biological control；orthogonal array design；fermentation conditions

Q939.1

A

1002-6630(2010)23-0128-04

2010-06-28

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD01A16)；山西省留學人員科研項目(2008-119)；山西省科技攻關項目(20100311001-7)；山西省高校學科建設專項資金項目(2010)

張麗珍(1977—)，女，副教授，博士，研究方向為生物資源篩選及利用。E-mail：lizhen@sxu.edu.cn