不同中和劑對米根霉發酵產L-乳酸的影響

姜紹通，張巧蘭，吳學鳳，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

不同中和劑對米根霉發酵產L-乳酸的影響

姜紹通，張巧蘭，吳學鳳，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009)

在米根霉發酵產L-乳酸過程中，采用CaCO3作為中和劑會造成下游分離過程中膜堵塞和環保壓力，因此以NH3·H2O和NaOH替代CaCO3作中和劑，對米根霉發酵產L-乳酸的工藝條件和發酵動力學進行研究。結果表明：添加CaCO3后L-乳酸產量平均提高7.3倍；NaOH、NH3·H2O作為中和劑的最佳濃度及質量分數分別為10mol/L、25%，以該條件進行發酵72h得菌絲體小球直徑分別為0.2～1.2mm和1.2～2.2mm，殘糖含量分別為2.58g/L和1.37g/L，L-乳酸產量分別為74.34g/L和80.61g/L。

米根霉；L-乳酸；中和劑；發酵動力學

L-乳酸是一種重要的天然有機酸，廣泛應用于食品、醫藥、生物降解塑料等領域[1-3]。自然界中可產生L-乳酸的微生物有很多，但米根霉因其營養要求簡單，產酸能力強且產品的光學純度高而被普遍應用于工業生產[4-6]。在L-乳酸的發酵過程中，發酵生成的L-乳酸可以作為一種解偶聯劑，使質子從培養基中進入細胞的質子泵。在這種情況下，細胞的生長和L-乳酸的生成都會隨著終產物L-乳酸的積累受到抑制。因此，發酵過程中培養基的pH值和發酵產生的游離L-乳酸都會對米根霉菌體的生長和產物L-乳酸的生成帶來影響[7-8]。在傳統的L-乳酸發酵工藝中，CaCO3是使用最為普遍的酸中和劑[8-9]。但使用CaCO3作為中和劑時，發酵罐中大量的CaCO3容易使取料口堵塞；在菌體生長過程中，容易產生米根霉菌體包埋現象；在發酵中后期，高濃度的乳酸鈣使發酵液變得黏稠，生成大量泡沫，造成跑料，易染菌[10]；或發生固化現象，使發酵難以繼續。另外，使用CaCO3作為中和劑時，發酵液的主要成分是粗乳酸鈣，在L-乳酸的下游分離提取過程中，產生的大量硫酸鈣不僅在過濾中會造成膜堵塞，造成乳酸損失，而且產生的大量硫酸鈣廢渣會造成嚴重的環保壓力和廢渣處理成本，不利于L-乳酸大規模生產的可持續發展[11-12]。因此，尋求新型中和劑代替傳統的CaCO3中和劑具有十分重要的現實意義，受到乳酸生產商和研究者的高度關注。本實驗通過以NaOH和NH3·H2O替代CaCO3作為米根霉發酵產L-乳酸的中和劑，以L-乳酸產量為指標，對Ca2+添加量、菌體形態、中和劑最適濃度和發酵動力學進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉AS3.819為合肥工業大學生物與食品工程學院發酵實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養基

菌種保藏斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)；以NaOH作為中和劑發酵培養基(g/L)：葡萄糖120、 (NH4)2SO44.0、MgSO4·7H2O 0.35、ZnSO4· 7H2O 0.22、NaH2PO40.10、KH2PO40.15；以NH3· H2O作為中和劑發酵培養基(g/L)：葡萄糖 120、 (NH4)2SO41.0、MgSO4·7H2O 0.35、ZnSO4·7H2O 0.22、NaH2PO40.15、KH2PO40.15。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發酵

250mL三角瓶中裝液量50mL，121℃滅菌15min，接種1mL孢子懸液(5×106個/mL)，200r/min搖床上32℃振蕩培養72h。

1.2.27 L發酵罐發酵

7L發酵罐中裝液量5L，通氣量6L/min，攪拌轉速300r/min，pH值：分別流加NaOH、NH3·H2O溶液均保持pH值在5.5左右，32℃下培養72h。

1.3 檢測方法

L-乳酸產量測定：HPLC法[13]；還原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸(DNS法)；生物量測定：菌體干質量法[14]。

2 結果與分析

2.1 Ca2+添加量的影響

Ca2+在菌絲體的生長和菌絲球的形成過程中起著非常重要的作用。分別以NaOH、NH3·H2O作為中和劑，在發酵培養基中加入不同量的CaCO3和CaCl2進行搖瓶實驗，結果如圖1～4所示。

圖1 NaOH作中和劑CaCl2質量濃度對L-乳酸產量的影響Fig.1 Effect of CaCl2concentration onL-lactic acid production with NaOH as the neutralizer

圖2 NaOH作中和劑CaCO3質量濃度對L-乳酸產量的影響Fig.2 Effect of CaCO3concentration onL-lactic acid production with NaOH as the neutralizer

圖3 NH3·H2O作中和劑CaCl2質量濃度對L-乳酸產量的影響Fig.3 Effect of CaCl2concentration onL-lactic acid production with NH3·H2O as the neutralizer

圖4 NH3·H2O作中和劑CaCO3質量濃度對L-乳酸產量的影響Fig.4 Effect of CaCO3concentration onL-lactic acid production with NH3·H2O as the neutralizer

由圖1、3可知，添加Ca2+后L-乳酸產量顯著提高。隨著CaCl2質量濃度增加，L-乳酸產量先上升后下降，可能是高質量濃度的Cl-對菌體有毒害作用，因此不采用CaCl2；由圖2、4可知，隨著CaCO3質量濃度增加，L-乳酸產量不斷提高，參照最佳CaCl2最佳質量濃度，選用2g/L CaCO3，因CaCO3易在發酵罐中沉淀，無法完全利用，可適當增加CaCO3用量。如圖1、2所示，以NaOH作為中和劑時，添加CaCO3和CaCl2后L-乳酸最大產量分別是未添加Ca2+的8.8倍和6.6倍。如圖3、4所示，以NH3·H2O作為中和劑時，添加CaCO3和CaCl2后L-乳酸最大產量分別是未添加Ca2+的8.5倍和5.3倍。

2.2 中和劑質量濃度對L-乳酸產量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

2.2.1 NaOH濃度對L-乳酸產量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

在7L發酵罐中對NaOH濃度進行優化，且由于低產量NaOH溶液和高濃度NaOH溶液加入的量不同使最終L-乳酸濃度產生差別，因此將發酵完成時的發酵罐總體積內L-乳酸的質量與初始葡萄糖質量進行對比得出L-乳酸/葡萄糖總得率，結果如圖5所示。

圖5 NaOH濃度對L-乳酸產量及L-乳酸/葡萄糖得率的影響Fig.5 Effect of NaOH concentration onL-lactic acid production and the ratio ofL-lactic acid production to initial glucose amount

由圖5可知，在2～10mol/L范圍內，L-乳酸產量隨著NaOH濃度增大而增多，L-乳酸/葡萄糖得率也不斷增加；而超過10mol/L時L-乳酸產量下降，可能是隨著NaOH濃度的增加，堿性增強，流加時發酵罐內局部堿性很大，對菌體的毒害作用增強，導致部分菌體死亡，有效菌體量減少，從而使L-乳酸產量相應減少，L-乳酸/葡萄糖得率也下降，因此選擇10mol/L為最佳濃度，在此濃度下L-乳酸產量為74.34g/L。

2.2.2 NH3·H2O質量分數對L-乳酸產量及L-乳酸/葡萄糖總得率的影響

圖6 NH3·H2O質量分數對L-乳酸產量及L-乳酸/葡萄糖得率的影響Fig.6 Effect of NH3·H2O concentration onL-lactic acid production and the ratio ofL-lactic acid production to initial glucose amount

在7L發酵罐中對NH3·H2O質量分數進行優化，且由于低質量分數NH3·H2O和高質量分數NH3·H2O加入的量不同使最終L-乳酸產量產生差別，因此將發酵完成時的發酵罐總體積內L-乳酸的質量與初始葡萄糖質量進行對比得出L-乳酸/葡萄糖總得率，結果見圖6。

由圖6可知，隨著NH3·H2O質量分數的增大，L-乳酸產量不斷上升，L-乳酸/葡萄糖得率也不斷增加，分析原因可能是因為NH3·H2O不僅能中和發酵產生的L-乳酸，還可以作為氮源促進米根霉菌體的生長，L-乳酸的產生導致發酵罐內p H值下降，NH3·H2O流加進入發酵罐，發酵液中NH4+濃度不斷增加，NH4+一部分作為氮源供米根霉菌體生長所用，一部分中和L-乳酸產生L-乳酸銨，因此NH3·H2O可能是米根霉發酵產L-乳酸比較理想的中和劑。由于市面所售NH3·H2O最高質量分數為25%，因此選擇25% NH3·H2O，此質量濃度下L-乳酸產量為80.61g/L。

2.3 不同中和劑的菌體形態

分別使用10mol/L NaOH和25% NH3·H2O作為米根霉發酵產L-乳酸的中和劑，在7L發酵罐中發酵7 2 h，發酵液澄清透明，米根霉菌體形成菌絲體小球，無任何碳酸鈣包埋現象，其中以N H3·H2O作為中和劑時，米根霉的菌體形態較為合適，NaOH作為中和劑時菌球偏小，如表1所示。發酵初期的前24h，米根霉菌體呈絮狀，24h后開始形成菌絲體小球，到發酵終點時菌體絲小球直徑分別為0.2～1.2mm和1.2～2.2mm，發酵終點米根霉菌絲體小球形態如圖7、8所示。

表1 中和劑對米根霉菌絲體生長的影響Table 1 Effect of neutralizers on mycelial growth ofRhizopus oryzae

圖7 NaOH作為中和劑時的菌球形態Fig.7 Mycelial pellets ofRhizopus oryzaewith NaOH as the neutralizer

圖8 NH3·H2O作為中和劑時的菌球形態Fig.8 Mycelial pellets ofRhizopus oryzaewith NH3·H2O as the neutralizer

2.4 不同中和劑的發酵動力學

2.4.1 以10mol/LNaOH作為中和劑時發酵動力學曲線

測定發酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質量濃度和L-乳酸質量濃度，得出以10mol/L NaOH作為米根霉發酵產L-乳酸中和劑的動力學，結果如圖9所示。

圖9 以NaOH作為中和劑的發酵動力學曲線Fig.9 Fermentation kinetic curve with NaOH as the neutralizer

由圖9可知，米根霉菌體的生長曲線和L-乳酸的生成曲線都呈S形。發酵初期0～24h，以菌體的生長為主，產酸很少，葡萄糖消耗速度緩慢。24h后進入產酸旺盛期，L-乳酸的合成與米根霉菌體的生長同步，L-乳酸產量增加的趨勢與米根霉菌絲體增長的趨勢基本一致，葡萄糖的消耗速度加快。54h后菌絲體含量變化不大，耗糖速度和產酸均變緩慢，發酵進入穩定期，72h發酵結束，L-乳酸的產量達到峰值。

2.4.2 以25% NH3·H2O作為中和劑時的發酵動力學曲線

圖10 以NH3·H2O作為中和劑的發酵動力學曲線Fig.10 Fermentation kinetic curve with NH3·H2O as the neutralizer

測定發酵液中的米根霉生物量、葡萄糖質量濃度和L-乳酸質量濃度，研究以25%NH3·H2O作為米根霉發酵產L-乳酸中和劑的菌體生長、糖代謝和產酸動力學，結果如圖10所示。

由圖10可知，米根霉菌體的生長曲線和L-乳酸的生成曲線都呈S形，葡萄糖消耗曲線呈反S形。發酵初期12h，菌體生長緩慢，菌絲體含量與L-乳酸產量很少。24～60h進入米根霉生長與L-乳酸生產旺盛期，菌體迅速生長，葡萄糖的消耗速度加快，L-乳酸產量也隨之迅速增加。60h后進入穩定期，L-乳酸增加緩慢，72h發酵結束，L-乳酸產量達最高值。

3 結 論

本研究利用NaOH和NH3·H2O作為米根霉發酵產L-乳酸的中和劑，通過Ca2+添加量、菌體形態、中和劑最佳濃度、動力學測定研究得出：Ca2+在米根霉菌體生長過程中起非常重要的作用，其中CaCO3優于CaCl2，添加了CaCO3后L-乳酸產量平均提高7.3倍；NH3·H2O、NaOH作為米根霉發酵產L-乳酸中和劑的最佳濃度及質量分數分別為25%和10mol/L，在最佳質量濃度下進行7L罐發酵72h，殘糖量分別達到2.58g/L和1.37g/L，L-乳酸產量分別達到74.34g/L和80.61g/L。

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Effect of Different Neutralizers on L-Lactic Acid Production by Rhizopus oryzae

JIANG Shao-tong，ZHANG Qiao-lan*，WU Xue-feng，LUO Shui-zhong，PAN Li-jun
(Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Calcium carbonate added as the neutralizer during Rhizopus oryzae fermentation for L-lactic acid production would cause membrane fouling and environmental pressure during the downstream separation. As a consequence, ammonia and sodium hydroxide were separately used as a substitute for calcium carbonate in this study, and the fermentation conditions for L-lactic acid production and the fermentation kinetics were dealt with. Added calcium carbonate during during Rhizopus oryzae fermentation resulted in an average 7.3-fold increase in L-lactic acid production. The optimal concentrations of added ammonia and sodium hydroxide were 10 mol/L and 25%, respectively. Mycelial pellets in diameter ranges between 0.2 mm and 1.2 mm and between 1.2 mm and 2.2 mm were formed after 72 h fermentation under these concentration conditions, and the residual sugar amounts were 2.58 g/L and 1.37 g/L and the L-lactic acid concentrations in the fermentation broths were 74.34 g/L and 80.61 g/L, respectively.

Rhizopus oryzae；L-lactic acid；neutralizer；fermentation kinetics

TQ921.3

A

1002-6630(2010)23-0114-04

2009-12-22

國家“863”計劃項目(2007AA10Z361)；安徽省自然科學基金項目(090411015)

姜紹通(1954—)，男，教授，主要從事農產品生物化工研究。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn