雞源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗研究

李 萍 黃翠峰 （山東省青島市城陽區農業局 266109）

雞大腸桿菌病是大腸埃希氏桿菌引起的雞病的總稱。近年來，在一些養殖密集區廣泛流行，個別地方呈暴發性流行的趨勢，且在使用抗菌藥物防治后，療效往往不明顯。用藥時稍好，停藥后復發，發病率和死亡率居高不下。隨著養禽業的迅速發展與高度集約化飼養，雞大腸桿菌病已成為雞群重要的疾病之一[1]。

為了控制雞大腸桿菌在雞群中的傳播，對雞場采集的疑似大腸桿菌病例進行病原的分離和藥敏試驗研究，通過對雞源大腸桿菌進行分離純化、生化鑒定和藥敏試驗，檢測出藥敏試驗中分離到的大腸桿菌菌株對哪些藥物高度敏感，對哪些中度敏感，對哪些不敏感，以便能更好地指導對家禽進行科學用藥，減少損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 城陽某養雞場病雞、死雞的肝臟。

1.1.2 抗菌藥物 氨基糖苷類：慶大霉素(GEN)、新霉素(NEO)、鏈霉素(STR)、安普霉素(ANP)、阿米卡星(AN)。氟喹諾酮類：諾氟沙星(NOR)、恩諾沙星(ENO)、環丙沙星(CIP)、達氟沙星(DFL)、左氧氟沙星(OFL)。大環內酯類：大環霉素、泰樂菌素。硫酸菌素類：硫酸黏菌素。雙萜類：泰妙菌素

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備 肉湯：稱取12.5g溶于500ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，經121℃15min高壓滅菌，置于4℃保存備用。營養瓊脂：稱取33g于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，經121℃15min高壓滅菌，制成平板和斜面，置于4℃保存備用。麥康凱瓊脂：稱取55g溶于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，115℃20min高壓滅菌，制成平板，置于4℃保存備用。三糖鐵瓊脂：稱取32.5g于1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝試管，115℃15min高壓滅菌，制成高層斜面，置于4℃保存備用

1.2.2 大腸桿菌的接種 無菌采取病雞、死雞的肝臟接種在麥康凱瓊脂平板，平板倒置于37℃溫箱培養24h。

1.2.3 大腸桿菌的增菌與分離純化 從培養24h的麥康凱瓊脂平板上挑取粉紅色、邊緣光滑的大腸桿菌可疑菌落接種于肉湯中，37℃恒溫培養24h進行增菌。將純化的大腸桿菌接種到瓊脂斜面，37℃恒溫培養24h。然后用20%甘油生理鹽水沖洗斜面，4℃保存。

1.2.4 大腸桿菌的生化鑒定（1）五糖發酵試驗。在無菌操作臺上，用接種針將分離純化的疑似大腸桿菌單菌落接種于五糖微量反應管，并封口標號，置于37℃恒溫培養22～24h。（2）三糖鐵試驗。用接種針將疑似大腸桿菌單菌落劃線接種于三糖鐵斜面上并進行穿刺，37℃恒溫培養22～24h。（3）IMVC試驗。將疑似大腸桿菌的菌樣分別接種于蛋白胨水培養基(吲哚試驗)，葡萄糖蛋白胨水培養基(甲基紅試驗和VP試驗)，檸檬酸鹽斜面培養基(檸檬酸鹽試驗)中，置于37℃ 2d[6]。（4）尿素酶試驗。用接種針將疑似大腸桿菌菌落接種于尿素微量反應管，37℃恒溫培養22～24h。（5）枸櫞酸鹽試驗。用接種針將疑似大腸桿菌菌落接種于枸櫞酸鹽微量生化反應管，37℃恒溫培養22～24h。

1.2.5 大腸桿菌的藥敏試驗（1）標準菌液的制備。①肉湯增菌：在已分離純化的待測菌平板上挑取4～5個相同菌落，接種到3～5ml MH肉湯中，置于35℃增菌2～8h[7]，以待生長至輕微或中等濁度。根據平板計數法測出菌液所需稀釋倍數以制成標準菌液，使菌液中細菌的濃度為108個/ml，稀釋時用生理鹽水或MH肉湯。平板計數：編號，取無菌平板18套，分別用記號筆標明10-6、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12(稀釋度)各3套。另取4支盛有4950μl無菌水的試管，依次標示10-2、10-4、10-6、10-8，另取4支盛有4.5ml無菌水的試管，依次標示10-9、10-10、10-11、10-12。稀釋：用微量加樣器取50μl已充分混勻的大腸桿菌菌懸液，加至10-2試管中，此即為100倍稀釋。將10-2試管置于試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。取一支1ml吸管插入10-2試管中來回吹吸菌懸液3次，進一步將菌體分散、混勻。用微量加樣器取10-2菌液50μl加至10-4試管中，此即為104倍稀釋，以此類推，至10-8試管時，用微量加樣器取0.5ml菌懸液加至10-9試管中，混勻。之后進行10倍稀釋，整個過程表1所示。②大腸桿菌菌懸液。取樣：用6支1ml無菌吸管分別吸取10-6、10-8、10-9、10-10、10-11和10-12、的稀釋菌懸液各1ml，對號放入編好號的每個無菌平皿中。倒平板：盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養基約15ml/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。待培養基凝固后，將平板倒置與37℃恒溫培養箱中培養。計數：培養48h后，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算：每毫升菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數。一般選擇每個平板上長有30～300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不準確。③肉湯菌液的稀釋。根據平板計數結果可以得出每毫升肉湯菌液中含有的細菌個數，然后按照相應的稀釋倍數將菌液稀釋至108個/ml，即為標準菌液。（2）抗生素原液的制備。配制各種抗菌藥物原液的溶劑和稀釋劑不盡相同，可參考下表2，原液濃度常為測定最高濃度的10倍以上。原液配好后用過濾法除菌，小量分裝備用。大部分抗菌藥物原液在-20℃以下保存3個月，在4℃下保存1周[7]。（3）藥物敏感性的測定。用肉湯常量稀釋法對大腸桿菌的藥物敏感性進行測定。①抗菌藥物的稀釋。將每種藥物用其相應的稀釋劑稀釋至待測最高濃度的兩倍。另取9支試管，每支試管中加MH肉湯2ml，向第一支試管中加入2ml稀釋的待測抗菌藥物，依次對倍稀釋至第8管，第9管不加抗菌藥物，第10管只加肉湯作為對照。②測試菌的準備。用MH肉湯10倍稀釋標準菌液，使之含菌量為107個/ml。③接種。用微量加樣器取0.1ml待測菌液依次由低濃度到高濃度加到各稀釋度的試管中，最終接種菌量約為5×105個/ml。加樣時加樣器吸頭需插至管內液面下加菌并注意避免與管內壁接觸，加好菌液后的試管應避免晃動。④孵育及閱讀結果。35℃孵育16～20h后，完全抑制測試菌肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MIC。

表1 平板計數法稀釋過程

表2 常用抗菌藥物的溶劑及稀釋劑

2 結果與分析

2.1 生化鑒定結果

葡萄糖、乳糖均能被利用產酸產氣，麥芽糖和甘露糖可被利用產酸，而蔗糖則不能被利用。（1）吲哚試驗：在培養48h后的蛋白胨水培養基內加3～4滴乙醚，搖動數次，靜置1～3min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入兩滴吲哚試劑，在乙醚和培養物之間產生紅色環狀物為陽性反應。（2）甲基紅試驗：培養48h后，將葡萄糖蛋白胨水培養物內加入甲基紅試劑2滴，培養基變為紅色為陽性。（3）VP試驗：培養48h后，將葡萄糖蛋白胨水培養物內加入5～10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恒溫箱中保溫15～30min，以加快反應速度。反應結果為陰性。（4）檸檬酸鹽試驗：培養48h后觀察弄檬酸鹽斜面培養基上有無細菌生長和是否變色。結果呈綠色為陰性。

另外在尿素酶試驗和枸櫞酸鹽試驗中反應結果都為陰性。

以上鑒定結果符合大腸桿菌的生化特征，本試驗成功分離出3株大腸桿菌。

表3 生化鑒定結果

2.2 菌落計數結果

表4 菌落計數結果

選擇每個平板上長有30～300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適，因此，選取10-9稀釋度較為合適，則肉湯菌液的菌落密度為5.1×1010cfu數/ml。將該菌液稀釋500倍即可制成標準菌液。

2.3 藥敏試驗結果

其中全部3株大腸桿菌都對硫酸慶大霉素、硫酸安普霉素、硫酸黏菌素、恩諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、環丙沙星、硫酸新霉素敏感。對大環霉素一株中度敏感，兩株不敏感即耐藥。對硫酸鏈霉素1株中度敏感，兩株耐藥。其中全部三株大腸桿菌對泰妙菌素耐藥，而泰樂菌素則不起任何有效作用。

表5 各種抗生素對大腸桿菌的MIC及MIC (μg/ml)

3 討論

試驗結果表明，大腸桿菌除對硫酸慶大霉素、硫酸黏菌素、恩諾沙星、諾氟沙星、達氟沙星、左氧氟沙星、阿米卡星、硫酸新霉素、環丙沙星有較高的敏感性外，對其他抗菌藥物鏈霉素、大環霉素、硫酸安普霉素、泰妙菌素、泰樂菌素等具有不同程度的抗藥性，這可能與大腸桿菌的耐藥性質粒基因的差異有關。對于有的藥，原來是敏感的，但現在不敏感，可能是因為藥物存放時間過長其抗菌性減弱及其操作過程中人為因素所導致，因此，對結果應當綜合評定。這對臨床上正確、合理地選用抗菌藥物有一定參考意義。正確利用藥敏試驗的結果，從而選取高效藥物對患病家禽進行治療。平時應當多注意積累經驗，掌握技巧，就能真正在實際生產中發揮積極的作用。

[1]汪毅,劉永德,劉帥等.雞大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗[J].上海畜牧獸醫通訊,2001,6(4):18-19.

[2]許蘭菊,蔣媛媛,劉紅英等.雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與藥敏試驗研究[J].河南農業大學學報,2003,12(4):392-395.

[3]牛藝儒，寧官保.大腸桿菌的藥敏試驗[J].山西農業大學學報，2005, 12(5)：30-34.

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[5]Fenover,F.C.and J.Tokars.Ability of clinical laboratories to detect antimirobial resistant enterocci[J].Clin Microbial,2003,12(31):17-18.

[6]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,2004,120-123.

[7]管遠志,王艾琳,李堅.醫學微生物學實驗技術[M].北京: 化學工業出版社,2005,8:115-117.