食源性致病菌多重分子生物學檢測技術研究進展

索 標 ,汪月霞 ,艾志錄

( 1 .河南農業大學食品科學技術學院,河南鄭州 450002 ; 2 .河南農業大學生命科學學院,河南鄭州 450002 )

食源性致病菌多重分子生物學檢測技術研究進展

索 標1,汪月霞2,艾志錄1

( 1 .河南農業大學食品科學技術學院,河南鄭州 450002 ; 2 .河南農業大學生命科學學院,河南鄭州 450002 )

快速、可靠的食源性致病菌高通量檢測方法對于確保食品安全具有重要意義,近年基于DNA水平的多重分子生物學檢測技術迅速發展,針對各種不同的食源性致病菌建立了多種多重分子檢測技術,包括多重PCR、多重實時熒光PCR以及基因芯片等。對這些多重分子檢測技術的最新研究進展作一綜述,并且建議在今后該技術的研究中,仍需要在食品中多種致病菌同時選擇性增菌培養、亞致死損傷修復以及檢測內標的構建等方面取得突破,從而能夠更好地實現食源性致病菌的高通量檢測。

多重分子方法;食源性致病菌;多重PCR;基因芯片;檢測

食源性致病菌已經被公認是造成食品污染的重要原因之一,甚至可能會造成人類的死亡,常規的微生物學檢測方法如平板菌落計數法和最大或然數法(MPN)等耗時耗力,需要5～7 d才能完成整個檢測過程。食源性致病菌的快速檢測和鑒定方法對食品企業內部安全衛生監控極為重要,政府部門也急需發展這些快速檢測技術來用于履行食品安全監管職能。多重分子生物學檢測方法由于在一個反應體系中同時完成多個檢測目的[1],目前已經成功應用于食源性致病菌的安全檢測,并建立了多重PCR、多重實時熒光PCR、基因芯片等多種檢測技術。本文將對這些多重分子檢測方法的研究進展作一綜述,并針對這些方法在食源性致病菌安全檢測應用中的關鍵技術問題和難點以及未來發展趨勢提出意見。

1 食源性致病菌多重分子檢測技術

1.1 多重PCR(M ultiplex PCR)

多重PCR技術是普通PCR技術的一種延伸,該技術在一個擴增體系中含有多對引物,可同時完成多個目的片段的擴增,達到多種檢測的目的。現在該技術不僅用于多種致病菌的同時檢出,如丁久法等[2]開發出的多重PCR方法用于大腸埃希菌O157和單核細胞增生李斯特菌同時檢測,也有研究將該方法用于同一致病菌毒素分泌型[3]、血清型[4]或耐藥[5]分型。影響多重PCR檢測結果的關鍵因素之一是引物的設計,要求所有設計引物的退火溫度必須非常接近,擴增產物大小的差別也要足夠大以能夠在瓊脂糖凝膠電泳中有效區分開來。同時,多重PCR引物的各擴增之間也不能有干擾,否則會使得多重PCR的擴增反應體系難以得到優化,這在引物對數量較多的反應體系中尤為關鍵[6]。Rachlin等[7]開發出一種基于互聯網的MuPlex軟件,該軟件根據相互作用參數、引物選擇標準以及達到檢測目標所需要的多重數,設計DNA序列的特異性引物,并為各靶點可能出現的競爭問題提供多種解決方案。此外,也有研究建議在多重PCR引物兩端加上接頭以解決各擴增之間的競爭問題[8]。Yuan等[9]開發出一種通用引物,由此設計的多重PCR檢測方法,可完成食品中沙門氏菌、大腸埃希菌和單核細胞增生李斯特菌的特異性同時高效檢出。

1.2 實時熒光PCR(Real-time PCR)

實時熒光PCR技術在核酸擴增過程中就能看到致病菌檢測的結果,因此,與傳統PCR方法相比,實時熒光PCR不需要后續的分析過程,從而顯著縮短了檢測的時間,也減少了實驗室環境對擴增反應所帶來污染的可能,該技術目前已經成為食源性致病菌檢測技術開發的熱點之一。此外,實時熒光PCR是一種定量檢測方法,可以用來測定各種樣品中致病菌的數目[10-11],因此在食品安全性風險評估中具有重要作用。用TaqMan探針進行的實時熒光PCR方法結合標記好的探針,根據熒光吸收波長的不同,可以在一個反應體系完成多個序列的擴增反應,同時檢測多個不同食源性致病菌。目前,已經有一些研究報道用多重實時熒光PCR的方法實現食品中多種致病菌的同時檢測。如利用多重實時熒光PCR方法完成沙門氏菌、大腸埃希菌O157和單核細胞增生李斯特菌的同時檢測[12];多重實時熒光PCR的方法檢測沙門氏菌中高致病性的血清型Choleraesuis以及Paratyphi C[13];多重實時熒光PCR方法同時檢出不同血清型的沙門氏菌,包括Enteritidis、Gallinarum、Typhimurium、Kentucky以及Dublin等[14]。Guion等[15]利用PCR擴增產物的解鏈溫度(Tm值)不同設計的多重實時熒光PCR檢測方法,根據各種重要毒力因子對致瀉性大腸埃希菌進行分型,可以在不需要昂貴的熒光探針的情況下完成多重檢測,節約了檢測的成本。然而,由于多重實時熒光PCR容易受到熒光檢測器數量的限制[16-18],當待測樣品中可能污染有大量多種致病性細菌時,很難用該方法完成高通量同時檢測。

1.3 基因芯片檢測技術(Microarray)

生物芯片技術是通過縮微技術,根據分子間特異性地相互作用的原理,將生命科學領域中不連續的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統,以實現細胞、蛋白質、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。1個基因芯片上可以含有成千上萬個探針,一次檢測可以同時檢出多種致病菌。因此,基因芯片技術大大提高了檢測工作的效率,為食源性致病微生物的高通量檢測提供了非常有用的工具[19]。近年來,單核苷酸微陣列已被成功應用到多種致病性細菌以及病毒的檢測與基因分型中,如Cremonesi等[20]建立的基于16S rDNA基因的可用于奶制品中15種致病性細菌檢測的基因芯片檢測方法,Wang等[21]開發出可用于13個食源性致病菌同時檢測的基因芯片技術,該技術的檢測靈敏度為102cfu。Suo等[22]與多重PCR擴增相結合,開發出可用于食品中大腸埃希菌O157∶H7、空腸彎曲桿菌、沙門氏菌以及單核細胞增生李斯特菌同時檢出的低密度芯片制作及檢測方法,在這些致病菌的高通量檢測中具有廣泛的應用前景。

目前,基因芯片技術在致病菌的檢測、診斷領域尚未得到廣泛應用,其中一個重要的原因在于該技術目前尚無可信的標準,不同的實驗室或試驗平臺得到的結果可能會各不相同,因此檢測的準確性、重復性也沒有保障[23-24]。為此,美國食品藥品監督管理局(FDA)專門啟動了基因芯片質量控制計劃(Micro Array Quality Control, MAQC)[25-26],對政府部門、學術界以及工業界各自建立的1300多個基因芯片技術體系及其標準進行比較、驗證。MAQC計劃的研究結果表明,影響芯片結果的關鍵因素在于生物樣品間的差別以及人為的因素,而并非該技術本身容易造成試驗結果的多樣性[27],這也表明不同試驗平臺所得到的基因芯片結果在理論上應該可以達到高度的一致性。該研究結果就為基因芯片技術在醫學診斷、病原性致病菌檢測領域的廣泛應用提供了理論上的可能。然而,該技術真正廣泛應用到實際操作中仍需要標準的、可靠的試驗儀器以及方法等[28-29],如在基因芯片檢測過程中,尚缺乏有效、簡便的方法以獲得足夠量的熒光標記DNA與芯片上的探針進行雜交,并獲得明顯的特異性陽性結果。此外,開發如此高通量的檢測方法,適宜的特異性分子檢測靶點也是一個亟需解決的制約因素。

2 食源性致病菌多重分子檢測方法的發展趨勢和難點

2.1 食品中多種致病菌的同時選擇性增菌是多重檢測技術的瓶頸

為了能夠真正在一個檢測平臺中完成多種食源性致病菌的同時檢測,必須有一種培養液能同時增菌培養多種目的致病菌。目前常用的多種致病菌非選擇性增菌液有緩沖蛋白胨水(buffered peptone water;Z3;Y3,BPW)、胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soy broth,TSB)以及營養肉湯(nutrient broth,NB)等,現已開發出一種通用預增菌培養液(universal preenrichment broth,UPB)可以用于多種食源性致病菌的同時增菌培養[30],該培養液可以從Difco Lab、Sparks、MD公司購買,并被許多檢測方法所采用[31-32]。Kawasaki等[33]開發出一種No.17增菌液,可以用于食品中沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌以及大腸埃希菌O157∶H7的同時非選擇性增菌培養,現在也已經應用于多重檢測平臺的開發[34]。然而,該類培養液中由于缺乏細菌生長抑制成分,不能選擇性地增菌培養檢測目的致病菌,因而不適用于背景菌群含量較高的食品樣品,如食品原料或未經加工的動植物食品樣品等。SEL培養液是新開發出來的應用于食品樣品中沙門氏菌、大腸埃希菌O157∶H7以及單核細胞增生李斯特菌3種致病菌同時選擇性增菌的培養基[35],該培養基中含有相應的細菌生長抑制物質,能有效的抑制食品中除這3種目的致病菌以外的其他背景菌群的生長,獲得盡可能多的目的致病菌,在這3種致病菌的多重檢測中具有廣闊的應用前景。

2.2 現代多重分子檢測方法不能忽視食品樣品中亞致死損傷細胞的存在

食品中致病菌存在的高度危害性需要有效的控制技術對其進行殺滅,然而,目前常用的加熱、高壓等食品安全控制技術處理后的致病性細菌常處于3種不同的狀態[36]:①未受到損傷的細胞,能夠在選擇性培養基和非選擇性培養基上正常生長;②受到損傷、但仍具有修復能力的細胞,該類損傷細胞不能在加有選擇性成分的培養基上生長,但能夠在非選擇性培養基上進行自我修復并增殖;③死亡細胞,該類細胞完全不具有活性,在選擇性培養基和非選擇性培養基上均不能生長。

食品樣品中亞致死損傷細胞的存在一方面可能高估活性細胞存在的數目[37],也有可能低估活性細胞存在的數目[38],特別是在當檢測前應用選擇性培養基對食品樣品進行預增菌培養時。只有重視食品中亞致死損傷細胞的存在,在基于DNA的分子生物學檢測之前,采用合適的方法對致病菌損傷關鍵部位進行修復,才能真正實現食源性致病菌的安全檢測。然而,目前在多重檢測過程中所采用的損傷細胞修復方法,大多采用不含選擇性成分的營養培養基,如UPB、TSB等[31,39],無法滿足目標檢測致病菌選擇性增菌的需要。因此,選擇合適的多重選擇性增菌培養液是食源性致病菌多重檢測的關鍵步驟之一。

2.3 可靠的分子生物學檢測結果需要有效的內標作為假性結果的指示物

擴增內標是加入到PCR反應體系中的非靶點特異性DNA序列,可以與目標DNA一起擴增,用以將PCR檢測過程中的可能出現的假陰性結果與真實的陰性結果區別開來。當用分子生物學的方法檢測食品或環境中的致病性細菌時,由于食品基質、DNA提取過程中殘留的有機酸以及其他多種因素均可抑制PCR擴增反應,影響分子生物學檢測的結果,因此,擴增內標現在已經被認為是分子生物學檢測技術所必須具有的[40]。用于PCR擴增的內標通常為加入反應體系的一段外源DNA序列,如果擴增內標所用的引物與檢測所用的引物相同,稱為競爭性擴增內標,如果2種引物不同,則為非競爭性擴增內標[41]。在傳統PCR反應中,擴增內標與檢測目標通過產物的大小相區分;在實時熒光PCR反應體系中,兩者通過探針信號的不同吸收波長相區分;在基因芯片檢測體系中,則一般用芯片上單獨的樣點和雜交結果來指示檢測結果的可靠性[42]。

目前已經開發出多種構建擴增內標的方法,包括雙鏈DNA、單鏈DNA、質粒、攜帶外源質粒的別種菌株、來源于其他菌株的基因組DNA等。Long等[11]首次采用DNA隨機排序的方法設計出一段獨特的I AC序列,該序列與檢測目標DNA序列具有相同的長度和GC含量,采用基因工程的手段將該I AC序列導入單核細胞增生李斯特菌中構建突變菌株后,將該突變菌株加入熒光定量PCR反應體系中,由此構建了一個新型的食品中單核細胞增生李斯特菌的檢測方法,該方法不僅可以用來指示檢測過程中可能出現的假陰性結果,也可以用于食品樣品中致病菌數目的定量檢測。

3 結 論

現在已經建立多種基于DNA水平的食源性致病菌多重分子檢測技術,由于這些技術所具有的高通量、快速、靈敏、高效以及特異性強的優點,在食源性致病菌的快速檢測中具有廣泛的應用前景。然而,未來該技術的研究仍需要在食品中多種致病菌同時選擇性增菌培養、亞致死損傷修復以及檢測內標等方面取得突破,以使得該類技術能夠更好地為食源性致病菌高通量檢測服務。

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Research Development on Multiplex Molecular Detection Methods of Foodborne Pathogens

SUO Biao1,WANG Yue-xia2,AI Zhi-lu1
(1.Coll.of Food Sci.&Technol.,2.Coll.of Life Sci.,Henan Agric.Uni.,Zhengzhou,450002)

Abstract:Rapid,dependable and high throughput methods to detect and characterize food borne pathogens is of great significance for food safety.Recently multiplex molecular methods based on molecular biology atDNA level have been developed rapidly,and established various multiplex molecular testing techniques including multiplex PCR, multiplex real-ti me fluorescence PCR and gene chip etc.The newest research progress was reviewed in this article, suggested that a breakthrough on the aspects of simultaneous selective enrichment,recovery of sublethal injured cells and construction of internal control in foods are still needed accordingly to serve for a better realization of high throughput detection of food borne pathogens.

multiplex molecular methods;food borne pathogens;multiplex PCR;gene chip;detection

Q93-33;R15

A

1005-7021(2010)06-0071-05

河南省重點科技攻關計劃項目(082102320006)

索標 男,講師。研究方向為食品微生物分子生態與食品質量安全。Tel:0371-63558150,E-mail:suobiao@gmail.com

2010-11-13;

2010-11-21