CXCR4和VEGF在人腦星形細胞瘤中的表達及其與血管生成的關系

理國富 張鵬遠 牛光明 宋 樂 陶勝忠 尹先印 蘇芳忠

鄭州大學第二附屬醫院神經外科 鄭州 450014

血管生成是實體性腫瘤生長、增殖及轉移的基礎,與許多腫瘤的預后直接相關。研究表明,趨化因子及其受體CXCR4可促進腫瘤細胞的增值、遷移和血管生成,提示其與腫瘤的演進過程密切相關,而CXCR4各種生物學功能的實現,可能與VEGF的表達存在某種相關性,VEGF是腫瘤血管新生最重要的因子,在多種腫瘤的血管新生中起關鍵作用。因此,從趨化因子及其受體的角度來研究人星形細胞瘤侵襲和血管生成的機制,對認識腫瘤發生發展的機理和抗血管生成治療極為重要。本文將對星形細胞瘤CXCR4和VEGF的表達進行檢測,以探討其與臨床病理分級和血管生成的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2009-01～2009-07我院神經外科手術切除,并經病理證實為星形細胞瘤的患者新鮮標本43例,男25例,女18例,年齡3～72歲,平均37.13歲;所有病例術前均為首次發病,未行過放化療及免疫治療,有完整的臨床病歷資料。WHOⅠ～Ⅱ級合并為低度惡性組WHOⅢ-Ⅳ級合并為高度惡性組。另11例正常腦組織取自因腦外傷需行內減壓術的患者,所有標本離體后即置于液氮中,后轉至-80℃冰箱凍存備用。

1.2 引物及方法 根據GenBank提供的CXCR4和VEGF的m RNA序列,應用O ligo 5.0軟件自行設計引物,由上海賽百盛生物技術有限公司合成,序列見表1。用Trizol(Inviortegn公司)一步法提取組織中總RNA,測定純度定量后按照北京全式金公司逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA,PCR反應體系如下:cDNA 2μl,Forward primer 1μl,Reverse primer 1μl,10×easy taq buffer 5μl,2.5mMdNTP 4μl,Easy taq DNA Polymerase 0.5μl,最后加ddH2O至50μl。反應條件為94℃預變性5m in,94℃變性30sec,退火溫度見表1,時間為35sec,72℃延伸2m in,35個循環,72℃延伸10m in。取PCR產物5μl經2.0%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并攝像。應用Bandscan5.0計算條帶的積分光密度IA,IA=平均吸光度×面積,目的片段的相對表達強度用目的片段(IA)/內參(IA)的比值來表示。

1.3 統計學處理 采用SPSS 11.0軟件包處理數據,兩樣本率的比較采用四格表資料的χ2檢驗;計量資料采用 t檢驗;相關性檢驗用Spearman相關分析。結果判定以 P＜0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 電泳β-actin結果 β-actin在不同組別中均呈陽性表達(見圖1)。

圖1 β-actin在各組標本中的表達注:M:M aker,N:正常腦組織1、2、3和4分別為星性細胞瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級

表1 引物序列、退火溫度及產物大小

2.2 CXCR4在各組別中的表達 CXCR4在正常腦組織中的相對表達量為0.13±0.01,而在瘤組織中為0.73±0.15,差異顯著(P＜0.01)。見圖2-3;在Ⅰ～Ⅱ級和Ⅲ～Ⅳ級中的相對表達量分別為0.62±0.06、0.89±0.05,隨組織學級別升高相對表達量明顯增加,有統計學差異(t=16.19,P＜0.01)。見表2。

2.3 VEGF在各組中的表達 VEGF在正常腦組織中的相對表達量為0.15±0.01,而在瘤組織中為0.83±0.13,差異顯著(P＜0.01)。見圖4-5;在Ⅰ～Ⅱ級和Ⅲ～Ⅳ級中的相對表達量分別為0.72±0.05、0.97±0.04,隨組織學級別升高相對表達量有明顯增加,有統計學差異(t=19.08,P＜0.01)。見表2。

2.4 星性細胞瘤中CXCR4的表達與VEGF的相關性分析

CXCR4表達陽性的病例中,VEGF的陽性表達率為80.6%(25/31),CXCR4表達陰性的病例中,VEGF的陽性表達率為33.3%(4/12),經Spearman相關分析,二者基因的表達呈正相關(r=0.453,P=0.002)。見表3。。

表2 CXCR4和VEGF在瘤組織和正常腦組織中的表達

表3 CXCR4與VEGF表達的相關性

3 討論

趨化因子受體CXCR4屬于7次跨膜的G蛋白偶聯受體家族,可被其特異性配體SDF-1激活,構成SDF-1/CXCR4反應軸,轉導特定的信號、介導不同的效應,廣泛參與細胞的生長、發育、分化、凋亡等多種生理功能。2001年 Muller等[1]提出趨化因子及其受體在腫瘤的生長、侵襲和轉移中可能發揮著重要作用,很快引起學術界的廣泛重視,并隨之成為腫瘤研究的熱點。研究表明,CXCR4在多種腫瘤中表達異常[2],特異性封閉CXCR4可抑制成瘤率[3]。本研究發現CXCR4在正常腦組織中表達陰性或弱表達,而在星性細胞瘤中呈強陽性表達,占72.1%,Ⅰ～Ⅱ級和Ⅲ～Ⅳ級中CXCR4相對表達量分別為0.62±0.06、0.89±0.05,有隨病理分級增加表達增強趨勢,與Zhou等[4]的報告相符,提示CXCR4可能參與星性細胞瘤的增值和侵襲行為,并可作為評估其惡性程度和預后的一個指標。

VEGF是一高度特異的血管內皮細胞有絲分裂原,是腫瘤新生血管生成的重要調控因子。一致認為其能誘導腫瘤血管生成,而新生血管又為腫瘤細胞生長提供營養并間接促進腫瘤細胞增殖[5]。研究發現,在許多腫瘤組織中,VEGF呈高表達,且其表達水平與腫瘤的生物學特性有關[6]。本研究顯示:VEGF在正常腦組織中低表達(0.15±0.01),在星性細胞瘤中異常表達(0.83±0.13),且隨著病理級別增加表達增強,提示我們VEGF是腫瘤演進過程中的必要條件。

本文還顯示:星性細胞瘤中,CXCR4與VEGF的表達呈正相關(r=0.453,P=0.002),提示二者之間可能存在因果關系。國內Yang等[7]認為膠質瘤細胞CXCR4激活后會引起VEGF表達升高;膠質瘤細胞分泌的VEGF通過旁分泌方式作用于腫瘤周圍的血管內皮細胞受體而發揮功效,本文支持他的這一觀點。由此推測CXCR4與VEGF之間可能存在一個正負反饋機制,共同參與腫瘤的增值侵襲及血管生成過程。

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