過氧乙酸復方消毒劑殺滅枯草桿菌芽孢的實驗研究

曾宏逵,譚偉龍,錢萬紅,朱元元,季 昶,曹根寶

過氧乙酸是一種高效消毒劑,對各種微生物均有較強的殺菌效果[1],但因其較強的腐蝕性,實際應用中多使用其復方,以降低過氧乙酸的使用濃度并確保其殺菌效果[2]。為應對突發公共衛生事件應急洗消的需要,我們研制了含過氧乙酸、二氯二甲基海因和其他助劑等成分的復方消毒劑,在實驗室和模擬現場探討了其對枯草桿菌芽孢的殺菌效果,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 過氧乙酸為市售,有效含量為15%～17%,二氯二甲基海因由某消毒劑廠提供,取上述兩種消毒劑按不同有效含量混配配成A、B、C、D四種復方。試驗菌為枯草桿菌黑色變種芽孢(ATCC 9372,由軍事醫學科學院提供)。不銹鋼載體(直徑12 mm、厚0.5 mm)、模擬現場試驗用不銹鋼鋼管(圍繞鋼管口鋸凹槽數條),經脫脂處理,壓力蒸汽滅菌后,烤干備用。枯草桿菌黑色變種芽孢(以下簡稱枯草桿菌芽孢)的制備:將菌種分別接種于普通肉湯培養基管內,放入37℃恒溫箱中培養24 h。吸取肉湯培養物4 ～5 m l轉種于羅氏瓶普通瓊脂培養基上,37℃培養6 d。當鏡檢發現芽孢形成率超過95%時,每個羅氏瓶用10 ml0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗下芽孢,以無菌紗布過濾于三角燒瓶內。將三角燒瓶置45℃水浴箱中24 h進行芽孢斷鏈。用PBS沖洗芽孢懸液(3000×g離心,每次30 min)2次。將經洗滌的芽孢懸液放入60 ℃水浴箱中30 min,以殺滅細菌繁殖體,將芽孢液計數后放入4℃冰箱備用。菌懸液和菌片的制備:試驗前,用含10 g/L胰蛋白胨的TPS培養基制成菌懸液,吸取部分菌懸液制作菌片,部分菌懸液與有機干擾物1∶1混勻備用[3]。

1.2 實驗方法

1.2.1 中和劑選擇試驗 試驗分為6組,以枯草桿菌芽孢為代表菌,按懸液定量殺菌試驗程序進行[3-4]。

1.2.2 懸液定量殺菌實驗[4-5]按每試管4 ml消毒液(陽性對照為TPS)于(20±1)℃水浴中平衡溫度10 min,加入1 ml菌懸液,作用至預定時間,吸取0.5 ml菌、藥混懸液加入4.5 ml中和劑中,混勻,中和10 min。混勻后吸取1ml樣液接種平皿,傾注瓊脂,將平板置37℃恒溫箱培養,72 h后觀察結果,計數菌落數并計算殺滅對數值。

KL=lgN1-lgNt(KL:殺滅對數值;N1:對照組平均活菌濃度;Nt:實驗組活菌濃度)

1.2.3 載體定性殺菌實驗 在無菌平皿里按每片菌片5.0 ml的量加入消毒液(陽性對照為硬水)于(20±1)℃水浴中平衡溫度5 min,用無菌鑷子分別放入預先制備的菌片,并使之浸透于消毒液中,作用至預定時間,用無菌鑷分別將菌片移入一含5.0 ml中和劑肉湯試管中,置37℃恒溫箱培養,7 d后觀察結果。實驗組無菌生長,陽性對照組正常生長,判定為滅菌合格。

1.2.4 模擬現場消毒實驗 按每件載體10.0 ml的量加入消毒液(陽性對照為硬水)于(20±1)℃水浴中平衡溫度5 min,將40 個端部染有枯草桿菌芽孢懸液的不銹鋼鋼管分別浸沒于消毒液中,每個復配液試驗10個樣本,作用至預定時間,用無菌鑷將不銹鋼鋼管放于盛有10.0 ml中和劑溶液的小燒杯中,中和10 min,混勻(必要時用TPS稀釋)后,吸取1ml樣液接種平皿,傾注普通營養瓊脂,將平板置37℃恒溫箱培養,72 h后觀察結果,計數菌落數并計算殺滅對數值。

1.2.5 消毒效果的評價 參照國家衛生部《消毒技術規范》中的相關規定進行評價。

2 結 果

2.1 中和劑選擇試驗結果 根據“中和劑選擇試驗”判別標準:試驗結果按第1組不長菌或菌落數遠少于第2組;第2組菌落數較第1組多,但較第3、4、5組少;第3、4、5組組間菌落數相差≤15.0%;第6組無菌生長時,所選中和劑及其濃度適宜。本試驗中用含10 g/L硫代硫酸鈉和0.5%吐溫-80 的TPS溶液可有效中和含量為500 mg/L有效氯溶液和1000 mg/L過氧乙酸的殘余作用,中和劑及中和產物對受試菌及培養基無影響,結果為3次試驗平均值(表1)。

表1 過氧乙酸復方消毒劑的中和劑選擇試驗結果

2.2 懸液定量殺菌實驗效果 不同濃度過氧乙酸復方消毒劑在25℃條件下,對枯草桿菌芽孢進行殺滅試驗。當有效氯與過氧乙酸的含量分別為300 mg/L與100 mg/L、100 mg/L與500 mg/L時,作用15 min,對芽孢的殺滅對數值均為4.00;當含量分別為300 mg/L和500 mg/L作用15 min,殺滅對數值達7.75;當含量分別為500 mg/L和1000 mg/L作用10 min,殺滅對數值即達7.74(表2)。

表2 過氧乙酸復方消毒劑對枯草桿菌芽孢殺滅結果

2.3 載體定性殺菌實驗效果 經5次實驗結果證明,以500 mg/L有效氯與1000 mg/L過氧乙酸組合及300 mg/L有效氯與500 mg/L過氧乙酸組合,對載體上枯草桿菌芽孢分別作用15、30、45 min,各次實驗的肉湯管均無菌生長,陽性對照肉湯管10支全部有菌生長,陽性對照組平均回收菌落數5.4×106CFU/片,陰性對照無菌生長。

2.4 模擬現場殺菌實驗結果 四種復方消毒劑對枯草桿菌芽孢分別作用10 min,殺滅對數值均達3.5以上,以有效氯與過氧乙酸的含量分別為500 mg/L和1000 mg/L時作用10 min,殺滅對數值達4.20 ～6.40(表3)。

表3 過氧乙酸復方消毒劑殺滅枯草桿菌芽孢的模擬現場實驗結果

3 討 論

近年來,隨著新發傳染病的不斷出現,部分舊的傳染病重新肆虐,特別是一些不明原因的傳染性疾病的出現,給疫源地現場消毒處置工作帶來了不少的麻煩[5-6]。高效消毒劑大多具有較強的腐蝕性,降低濃度來減輕腐蝕性又恐達不到消毒效果,因此本研究的目的就是要配制一種具有高效消毒效果的復方消毒劑,用于不明原因感染性疾病的疫源地消毒處置和被污染裝備的表面消毒。

實驗結果表明,在室溫下,含二氯二甲基海因及過氧乙酸的復方消毒液,對懸液中的枯草桿菌黑色變種芽孢均有較好的殺滅效果。含有500 mg/L有效氯與1000 mg/L過氧乙酸的A組復方消毒劑懸液殺菌時10 min的殺滅對數值達7.74,載體定性殺菌時15 min殺滅率達100%,模擬現場實驗時,作用10 min殺滅對數值達4.20 ～6.40,達到了高效消毒效果。

由于過氧乙酸的穩定性普遍較差,二元制劑雖有良好的穩定性,但使用前需合成24 ～48 h,不適合應急條件下使用,且合成后的濃度和穩定性也欠理想,難以實現用作較長時間的貯備[7-8],因此下一步研究中,要解決好該復方消毒劑儲存過程中的穩定性和有機物對殺菌效果影響的問題[9]。

[1] 姚楚水,王長德,楊 燕,等.過氧乙酸殺滅微生物效果的試驗觀察[J].中國消毒學雜志,2003,20(4):254-255.

[2] 錢萬紅,王忠燦,吳光華.消毒殺蟲滅鼠技術[M].北京:人民衛生出版社,2008:107-113.

[3] 沈建忠,趙國良,李茂全,等.過氧乙酸復方消毒劑殺菌效果及腐蝕性試驗觀察[J].中國消毒學雜志,2001,18(1):11-14.

[4] 邱洪流,謝 琴,謝 帆.兩種碘伏消毒液殺菌效果比較研究[J].中國消毒學雜志,2006,23(6):555-556.

[5] 汪茂榮.恙蟲病的流行病學與診治進展[J].東南國防醫藥,2009,11(6):526-529.

[6] 劉士軍.做好大型軍事演習部隊衛生防疫保障的幾點體會[J].東南國防醫藥,2009,11(3):285-286.

[7] 張志成,張曉玲,蔣麗娟,等.二元包裝過氧乙酸殺菌效果和儲存穩定性試驗觀察[J].中國消毒學雜志,2007,24(2):142-143.

[8] 譚偉龍,錢萬紅,沈建忠.過氧乙酸殺菌劑研究進展[J].醫學動物防制,2008,9(9):641-643.

[9] 曾宏逵,譚偉龍.某部隊醫院消毒滅菌效果的動態監測與分析[J].東南國防醫藥,2009,11(4):172-175.