多發(fā)性腦梗死性癡呆模型的建立及評(píng)價(jià)

應(yīng)鳳博 薛景鳳 高燕軍 米艷娟 楊廣成 趙曉麗 陳志宏

多發(fā)性腦梗死性癡呆模型的建立及評(píng)價(jià)

應(yīng)鳳博 薛景鳳 高燕軍 米艷娟 楊廣成 趙曉麗 陳志宏

目的 建立一種有機(jī)微血栓所導(dǎo)致的多發(fā)性腦梗死性癡呆動(dòng)物模型,模擬臨床上多發(fā)性腦梗死性癡呆病的發(fā)生。方法 于左側(cè)頸外動(dòng)脈逆行插管至左側(cè)頸總動(dòng)脈的分叉處后,注入有機(jī)微血栓,造成多發(fā)性腦梗死動(dòng)物模型。采用 Morris水迷宮的方法觀察多發(fā)性腦梗死性癡呆大鼠行為學(xué)變化,應(yīng)用光鏡觀察多發(fā)性腦梗死性癡呆大鼠海馬的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果 (1)行為學(xué)測試：模型組的學(xué)習(xí)成績較正常對照組和假手術(shù)組明顯下降。(2)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：HE染色：模型組左側(cè)腦組織多部位可見局部缺血性氣沉沉改變,神經(jīng)細(xì)胞胞體不同程度縮小,胞漿尼氏體減少或消失,核固縮,核碎裂,核溶解。Nissl染色：模型組實(shí)驗(yàn)側(cè)海馬 CA 1、CA 2、CA 3、垂直部、齒狀回等梗死區(qū)可見細(xì)胞排列稀疏,有明顯的細(xì)胞脫失,大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生,核固縮,胞漿內(nèi)尼氏體溶解,甚至消失。正常對照組和假手術(shù)組及模型組正常對照側(cè)無上述病理改變。結(jié)論 本模型是進(jìn)行多發(fā)性腦梗死性癡呆基礎(chǔ)研究和臨床研究的理想動(dòng)物模型。

多發(fā)性腦梗死性癡呆;動(dòng)物模型;大鼠;海馬;行為學(xué)測試

自 20世紀(jì) 70年代以來,陸續(xù)出現(xiàn)的大鼠腦缺血模型有幾十種,這些方法均有不足之處,在病理表現(xiàn)上均與多發(fā)性腦梗死性癡呆有一定差異。本實(shí)驗(yàn)參照Kaneko等[1-3]豬腦栓塞動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)并加以改進(jìn),利用正常人血漿纖維蛋白,創(chuàng)造一種有機(jī)微血栓,進(jìn)而建立一種有機(jī)微血栓所導(dǎo)致的多發(fā)性腦梗死性癡呆動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 Wistar成年大鼠 60只,10月齡,體重 250～350g,雌雄不限。將 60只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組和模型組,每組 20只,模型組實(shí)驗(yàn)過程中死亡 5例。

1.2 藥物與試劑 凝血酶,規(guī)格 500 U;0.9%氯化鈉溶液;水合氯醛;多聚甲醛;磷酸氫二鈉;磷酸二氫鈉;焦油紫;蘇木精;伊紅等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);高頻電刀;振蕩切片機(jī);Olympus光學(xué)顯微鏡等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 有機(jī)微血栓的制備：取正常人血漿(含血小板)1ml迅速加入凝血酶500U,凝固后置于 0.9%氯化鈉溶液中反復(fù)漂洗,用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將其打碎,使栓子直徑多在 20～40μm,再用0.9%氯化鈉溶液將其配成 10mg/ml的栓子混懸液。

1.4.2 模型組：大鼠術(shù)前禁食 12 h,禁水 4 h。選擇大鼠左側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)。用 10%水合氯醛(35mg/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉,仰臥固定,頸前部去毛,常規(guī)碘酒酒精消毒后,頸正中切開皮膚,剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌,充分暴露并分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及其枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及其翼腭動(dòng)脈(PPA),將枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈用高頻電刀電凝并剪斷。在分離過程中避免損傷迷走神經(jīng)及減壓神經(jīng),暫時(shí)夾閉頸CCA、PPA,于頸外動(dòng)脈逆行插管(在插管過程中,注意不要損傷血管內(nèi)膜,避免局部血栓形成)至頸 CCA的分叉處后,注入含有有機(jī)微血栓的混懸液0.5m l,推注同時(shí)開放夾閉的頸 CCA,并在不少于 30 s的時(shí)間內(nèi)緩慢注入,使栓子通過 ICA進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈,造成多發(fā)性腦梗死,然后開放夾閉的 PPA,在頸外動(dòng)脈刺破的傷口處結(jié)扎,逐層縫合頸部切口,腹腔內(nèi)注射 0.2萬 U青霉素以預(yù)防感染。手術(shù)整個(gè)過程中必須保證無菌。術(shù)中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃,以防止低溫對腦缺血損傷的保護(hù)作用。手術(shù)后將大鼠送至有通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備的動(dòng)物房正常喂養(yǎng)。正常對照組：不給予任何處理。假手術(shù)組：手術(shù)方法同模型組,注入頸內(nèi)動(dòng)脈的是 0.9%氯化鈉溶液 0.5m l。

1.4.3 行為學(xué)測試：假手術(shù)組和模型組術(shù)后第 8天與正常對照組開始采用 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮中加入奶粉 1 000 g,用水加至高過安全平臺(tái)1 cm。在池壁上標(biāo)上東南西北 4個(gè)入水點(diǎn),將圓形水池平均分為西南(SW)、西北(NW)、東南(SE)及東北(NE)象限,將安全平臺(tái)放置在 NE象限離箱壁 20 cm處。①定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)歷時(shí) 7 d,每天上、下午 2個(gè)時(shí)段,每個(gè)時(shí)段訓(xùn)練 2次。每只大鼠在訓(xùn)練前放于安全平臺(tái)2m in以熟悉迷宮環(huán)境。每次訓(xùn)練隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池,同一次訓(xùn)練所有大鼠入水點(diǎn)相同。記錄大鼠找到安全平臺(tái)的時(shí)間,即逃逸潛伏期。至 90s找不到安全平臺(tái),即將其引上安全平臺(tái),逃逸潛伏期記為 90s。每天 4次逃逸潛伏期的算術(shù)平均值作為這一天的學(xué)習(xí)成績。②空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練完畢當(dāng)天下午進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),撤除安全平臺(tái),記錄大鼠 90 s內(nèi)穿過原安全平臺(tái)位置的次數(shù)和在原安全平臺(tái)所在象限(NE象限)探索時(shí)間占總時(shí)間(90s)的百分比。③多發(fā)性腦梗死性癡呆大鼠的判定：取正常對照組和模型組訓(xùn)練第 7天的學(xué)習(xí)成績,以正常對照組游到安全平臺(tái)平均時(shí)間的 95%上限值為標(biāo)準(zhǔn),將超出上限值的缺血大鼠確定為多發(fā)性腦梗死性癡呆大鼠。經(jīng)分析,如大鼠逃逸潛伏期超過 4.60 s即為癡呆。

1.4.4 形態(tài)學(xué)觀察：組織切片的制備：在 10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉下,打開胸腔,升主動(dòng)脈插管,溫 0.9%氯化鈉溶液 100ml快速?zèng)_洗血管,繼之用 4%多聚甲醛 -0.1mol/L磷酸緩沖液灌流固定,開顱取腦,將腦組織浸入 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸緩沖液內(nèi)固定。取視交叉至腳間窩之間的一段腦組織(海馬所在部位),應(yīng)用 LEICA VT 1000S型振蕩切片機(jī)作連續(xù)冠狀切片,裱片并烘干,然后進(jìn)行尼氏(Nissl)染色和HE染色,分色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察海馬細(xì)胞構(gòu)筑的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢查結(jié)果 模型組的學(xué)習(xí)成績較正常對照組和假手術(shù)組明顯下降。在空間探索實(shí)驗(yàn)中,正常對照組和假手術(shù)組大鼠在 90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原安全平臺(tái)象限即NE象限探索時(shí)間占總時(shí)間(90 s)的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而模型組與正常對照組和假手術(shù)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表 1。定位航行實(shí)驗(yàn)中所有大鼠逃逸潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)增加而下降,3組大鼠均隨訓(xùn)練天數(shù)的增加而學(xué)習(xí)記憶成績增加,但模型組每天的學(xué)習(xí)記憶成績明顯慢于正常對照組和假手術(shù)組(圖1)。空間探索軌跡中可以更直觀的看到正常對照組在原安全平臺(tái)所在象限即NE象限探索時(shí)間長,路程長,穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)多,而模型組癡呆大鼠在原安全平臺(tái)所在象限即NE象限探索時(shí)間短,路程短,穿過原平臺(tái)位置的次數(shù)少(圖2、3)。模型組 15只大鼠中有 13只癡呆,癡呆率為 86.67%。

表1 3組大鼠 90 s內(nèi)穿過原安全平臺(tái)位置的次數(shù)和在原安全平臺(tái)所在象限(NE象限)探索時(shí)間占總時(shí)間(90 s)的百分比比較±s

表1 3組大鼠 90 s內(nèi)穿過原安全平臺(tái)位置的次數(shù)和在原安全平臺(tái)所在象限(NE象限)探索時(shí)間占總時(shí)間(90 s)的百分比比較±s

注：與模型組比較,＊P＜0.05

組別 次數(shù) 百分比(%)正常對照組(n=20) 7.6±1.5＊ 50±5＊假手術(shù)組(n=20) 7.4±2.3＊ 50±8＊模型組(n=15) 3.2±1.7 29±6

圖1 7d內(nèi)逃逸潛伏期變化

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 HE染色：模型組梗死率達(dá) 100%,模型組實(shí)驗(yàn)側(cè)腦組織多部位均可見點(diǎn)片狀局部缺血性改變,神經(jīng)細(xì)胞胞體不同程度縮小,核固縮,核碎裂,核溶解,可見失去正常結(jié)構(gòu)的紅色神經(jīng)元和格子細(xì)胞(圖2)。正常對照組和假手術(shù)組及模型組正常對照側(cè)無上述病理改變。

圖2 模型組大鼠試驗(yàn)側(cè)海馬CA 2形態(tài)改變(HE×200)

圖3 正常對照組大鼠海馬形態(tài)(Nissl×40)

圖4 假手術(shù)組大鼠海馬形態(tài)(Nissl×40)

圖5 模型組大鼠正常對照側(cè)海馬形態(tài)(Nissl×40)

圖6 模型組大鼠試驗(yàn)側(cè)海馬 CA 2和CA 3形態(tài)改變(Nissl×40)

圖7 模型組大鼠試驗(yàn)側(cè)海馬 CA 2形態(tài)改變(Nissl×100)

2.2.2 Nissl染色：低倍鏡下,正常對照組和假手術(shù)組及模型組正常對照側(cè)海馬各層細(xì)胞排列緊密,層次分明,細(xì)胞核及尼氏體均無任何改變(圖3～5)。模型組實(shí)驗(yàn)側(cè)海馬 CA 1、CA 2、CA3、垂直部、齒狀回梗死區(qū)可見細(xì)胞排列稀疏,有明顯的細(xì)胞脫失,大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生(圖6)。在觀察海馬的形態(tài)學(xué)變化時(shí)還發(fā)現(xiàn)有的癡呆大鼠在海馬的不同區(qū)同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞排列稀疏,有明顯細(xì)胞脫失,大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生。高倍鏡下,正常對照組和假手術(shù)組及模型組正常對照側(cè)各層細(xì)胞核膜完整,尼氏體清晰可見,細(xì)胞排列緊密,模型組海馬 CA 1、CA 2、CA3、垂直部、齒狀回梗死區(qū)形態(tài)正常的細(xì)胞數(shù)明顯減少,許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)變的不完整,大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生。在梗死灶附近可見周圍細(xì)胞有明顯改變,胞漿內(nèi)尼氏體減少,甚至消失,核溶解(圖7)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,所切片觀察的 10只癡呆大鼠在海馬上有 8只出現(xiàn)上述病理改變,出現(xiàn)率為 80%。正常對照組和假手術(shù)組及模型組正常對照側(cè)無上述病理改變。

文獻(xiàn)報(bào)道的血栓多為人或動(dòng)物全血凝固后形成的“紅色血栓”,實(shí)為凝血塊,其主要成分為紅細(xì)胞、血小板,纖維蛋白含量較少,松軟易碎,在體內(nèi)易自溶,栓塞血管可自然再通[4]。本模型所用血栓克服了上述缺點(diǎn),它是由含血小板的健康人血漿凝固而成的“白色血栓”,更接近于人類血栓栓子的成分,其主要成分為纖維蛋白,含少量血小板,柔軟而且有韌性,不易早期自溶。而且所用栓子直徑多控制在 20～40μm,大小不一,用0.9%氯化鈉溶液將其配成的栓子混懸液濃度為 10mg/m l。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠無肢體運(yùn)動(dòng)障礙,可能是由于所用栓子微小,梗死多為微小動(dòng)脈,栓子混懸液濃度適合的原因,達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期結(jié)果。

3 討論

我們認(rèn)為：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血管粗細(xì)與體重密切相關(guān),其體重越大,血管越粗,手術(shù)越容易成功,其體重越小,血管越細(xì),操作難度越大。但是體重的差別并不影響我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,原因主要是我們所用的是有機(jī)微血栓,而且所有大鼠的微小血管的直徑基本上是一樣的,并無太大的差別。

Morris水迷宮發(fā)現(xiàn),造模組大鼠出現(xiàn)了明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。形態(tài)學(xué)觀察大多癡呆模型大鼠可見在海馬不同區(qū)域有不同程度的細(xì)胞脫失,紅色神經(jīng)元和格子細(xì)胞,大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生等,這些形態(tài)學(xué)變化印證了行為學(xué)的結(jié)果。少數(shù)癡呆模型大鼠在海馬未發(fā)現(xiàn)異常,但在額葉皮質(zhì)、頂葉皮質(zhì)深層、背側(cè)丘腦、尾狀核、殼核、內(nèi)囊、胼胝體、齒狀回等部位發(fā)現(xiàn)栓子,且栓塞的血管不固定,在梗死灶附近可見周圍細(xì)胞明顯改變,這些變化說明癡呆與海馬之外的其他腦組織結(jié)構(gòu)有關(guān),也與梗死灶的多少有關(guān)。有研究結(jié)果表明,海馬是大鼠參與空間認(rèn)知功能的主要結(jié)構(gòu),但并非唯一的空間認(rèn)知結(jié)構(gòu),同時(shí)其他一些腦結(jié)構(gòu)亦對空間認(rèn)知功能產(chǎn)生影響。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出,80%癡呆大鼠在海馬上出現(xiàn)上述病理改變。這就進(jìn)一步說明了海馬是學(xué)習(xí)記憶的主要結(jié)構(gòu),也說明了海馬動(dòng)脈及其細(xì)小分支非常容易栓塞。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚顯示：從組間任一時(shí)點(diǎn)的橫向比較上看,模型組學(xué)習(xí)記憶成績比正常對照組和假手術(shù)組差;從自身不同時(shí)點(diǎn)的縱向比較上看,模型組隨著學(xué)習(xí)記憶的次數(shù)增多而成績有所好轉(zhuǎn),從而提示反復(fù)的練習(xí)可在一定程度上提高癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。有人認(rèn)為腦缺血大鼠引起的空間認(rèn)知功能障礙較為短暫,可能是大鼠單側(cè)腦梗死,正常側(cè)可部分代償[5]。模型組記憶能力比正常對照組和假手術(shù)組差,而肌力(游泳能力)測試與正常對照組和假手術(shù)組無差異,表明其逃逸潛伏期延長并非由于肌力不足所致。行為學(xué)測試和形態(tài)學(xué)觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本模型與多發(fā)性腦梗塞性癡呆的臨床癥狀及病理改變有極強(qiáng)的相似性,是進(jìn)行多發(fā)性腦梗死性癡呆基礎(chǔ)研究和臨床研究的理想模型。

1 KanekoD,NakamuraN,Ogawa T.Cerebral infarction in ratsusing homologous blood emboli：Development of a new experimental model.Stroke,1985,16：76-84.

2 陳俊拋,田時(shí)雨,于微微,等.多發(fā)性腦梗塞癡呆動(dòng)物模型的研究.中華神經(jīng)精神科雜志,1994,27：311-312.

3 陳銜城,秦智勇,張福林.豬腦栓塞動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià).中國臨床神經(jīng)科學(xué),1998,6：6-8.

4 Overgaard K.A ratmodel of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood c lot emboli.JCereb Blood Flow Metab,1992,12：484.

5 Lyden PD,Zivin JA,Chabolla DR,etal.Quantitative effectsofcerebral infarction on spatial learning in the rats.Exp Neurol,1992,116：122-132.

R 471

A

1002-7386(2010)06-0675-04

067000 河北省承德市,承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(應(yīng)鳳博、高燕軍、米艷娟、趙曉麗),小兒外科(楊廣成);承德醫(yī)學(xué)院解剖教研室(薛景鳳、陳志宏);

2010-02-01)