乙酰肝素酶在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

宋永彬 王志康 柳立軍 王會恩 周韶輝

乙酰肝素酶在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

宋永彬 王志康 柳立軍 王會恩 周韶輝

目的 探討乙酰肝素酶(Hpa)在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及其與NSCLC臨床病理特征間的關系。方法 應用RT-PCR和免疫組化方法檢測 52例 NSCLC術后組織標本及相應癌旁組織中 Hpa的表達,分析Hpa表達與 NSCLC臨床病理特征的關系。結果 NSCLC組織中存在 Hpa基因的表達,并定位于腫瘤細胞質和(或)細胞膜中。52例 NSCLC組織中有 39例Hpa基因 mRNA表達陽性(39/52,75%),癌旁組織有 11例表達陽性(11/52,21.2%),2組間差異有統計學意義(P＜0.01)。免疫組化染色 NSCLC組織中 Hpa陽性率 69.2%(36/52),癌旁組織陽性率 17.3%(9/52),2組間差異有統計學意義(P＜0.01),Hpa基因mRNA和蛋白質的檢測均顯示腺癌癌組織Hpa表達高于鱗癌,有淋巴結轉移的癌組織表達高于無淋巴結轉移組,TNM分期Ⅲ ～Ⅳ期的癌組織表達高于Ⅰ ～Ⅱ期,差異均有統計學意義(P＜0.01)。結論 NSCLC組織 Hpa基因及蛋白表達高于正常組織,并且與 NSCLC的轉移和進展有密切關系。

癌,非小細胞肺;乙酰肝素酶;淋巴轉移;腫瘤分期

近年來,肺癌的多學科綜合治療達到了一個新的水平,但肺癌的遠期治療效果仍不盡人意。研究提示治療失效的主要原因是腫瘤的復發(fā)和轉移。腫瘤侵襲、轉移是惡性腫瘤最重要也是最本質的生物學特征,是引起惡性腫瘤患者預后不良和死亡的主要原因。乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)可特異性降解細胞外基質和基底膜的主要成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,并且協同多種因子直接和間接地促進腫瘤的侵襲和轉移。Hpa在多種惡性腫瘤中表達水平高于其來源的正常組織,但非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中Hpa表達情況研究較少。為此,本實驗研究了 NSCLC患者術后癌組織標本中HpamRNA表達情況,分析其表達與臨床病理因素的關系,評價 Hpa在人 NSCLC侵襲和轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 52例非小細胞肺癌組織取自河北省人民醫(yī)院2005年 9月至 2007年 12月收治的非小細胞肺癌患者,均經手術治療,病理學確診,術前未接受化療及放療。每例均取癌組織以及癌旁組織(距離癌灶 5 cm處的正常肺組織),有淋巴結轉移的病例同時取其腫大淋巴結。其中男 37例,女 15例;年齡 37～78歲,平均年齡 58歲;按 WHO《肺腫瘤組織學分型》(1981)標準分類：鱗癌 30例,腺癌 22例;低分化癌 18例,中分化癌 22例,高分化癌 12例;pTNM分期(國際 UICC 1997分期標準)：Ⅰ a期 2例,Ⅰ b期 4例,Ⅱa期 7例,Ⅱb期 10例,Ⅲa期 14例,Ⅲb期 11例,Ⅳ期 4例;淋巴結轉移 40例。每例標本分為 2份,一份液氮保存,提取組織RNA;另一份 4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,行免疫組織化學染色。

1.2 Hpa基因引物 上游序列：5'TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3',下游序列：5'GTAGTGATGCCATGTAACTGAAT C3'538;采用 β-actin作 8為內參對照,引物序列上游：5'ATCTG-GCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG 3',下 游：5'CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC3'。以上引物均由上海生物工程公司合成。

1.3 PCR擴增 組織經液氮研缽勻漿后使用 Trizol(InVitrogen公司)RNA分離試劑提取總 RNA。經紫外分光光度計測定,RNA提取物 D 260/D 280均在 1.8～2.0。取 2μg RNA進行常規(guī) RT-PCR反應。反應條件為：37℃逆轉錄60min,94℃5min預變性;隨后進入 94℃ 60 s,57℃ 60 s,72℃ 60 s循環(huán)。35次循環(huán)后 72℃延伸 5min。以無菌雙蒸水代替 RNA模板擴增為 PCR空白對照。取 5μl擴增產物于 2%瓊脂糖凝膠電泳,DNA凝膠成像掃描儀(美國 fotodyne公司)攝像,進行光量子強度分析,Hpa與 β-actin比值作為 Hpa表達水平的參數。

1.4 免疫組化染色 采用SP法進行免疫組織化學染色(兔抗人 Hpa多克隆抗體購自武漢博士德公司,免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司),按說明書要求進行染色,PBS代替一抗作為陰性對照。結果以上皮組織和間質中細胞膜或細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性顯色。

1.5 統計學分析 應用 SPSS 12.0統計軟件,計量資料以±s表示,采用 t檢驗,計數資料采用 χ2檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC及癌旁組織中HpamRNA表達 Hpa基因擴增產物為 538 bp,NSCLC組織中 Hpa mRNA陽性率 75.0%(39/52),癌旁組織陽性率 21.2%(11/52),ESCC組織表達高于對照癌旁組織,2組差異有統計學意義(χ2=30.199,P＜0.01)。內參基因 β-actin擴增產物為 621 bp,所有組織中均有穩(wěn)定表達。HpamRNA表達陽性率與腫瘤的病理類型,分化程度,淋巴轉移和 TNM分期有關,與患者的性別、年齡和腫瘤的大小無明顯相關性。見表 1。

2.2 NSCLC及癌旁組織中 Hpa蛋白表達 癌組織中 Hpa陽性表達多見癌細胞膜和(或)細胞質中出現棕黃色染色胞漿內呈顆粒樣,在癌巢邊緣處肝素酶顯色較強。在肺癌間質不被染色。癌旁肺組織中,肝素酶在支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞中為陰性表達,在血管內皮細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞中呈不同強度的表達。NSCLC組織 Hpa陽性率 69.2%(36/52),癌旁組織陽性率 17.3%(9/52)。NSCLC組織表達高于對照癌旁組織,2組差異有統計學意義(χ2=27.110,P＜0.01)。Hpa蛋白表達陽性率同樣與腫瘤的病理類型,分化程度,淋巴轉移和 TNM分期有關,與患者的性別、年齡和腫瘤的大小無明顯相關性。

3 討論

腫瘤轉移的兩個必需條件為瘤細胞侵犯基底膜、細胞外基質和腫瘤血管生成。硫酸肝素蛋白多糖是細胞外基質的主要成分之一并與其它細胞外基質的主要成分密切協同形成腫瘤細胞轉移的重要屏障。Hpa的作用為降解硫酸肝素蛋白多糖的硫酸肝素側鏈,進而破壞其轉移屏障的作用[1]。在正常情況下肝素酶主要見于血小板、胎盤滋養(yǎng)葉母細胞和白細胞,在胚胎形態(tài)生成期、創(chuàng)傷愈合、組織修復和炎癥過程中起著重要的生理功能作用。研究表明,在子宮頸癌、骨腫瘤、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌以及乳腺癌和胰腺癌中,均呈 Hpa高表達[2-7]。而且,胰腺癌患者術后存活時間與Hpa表達水平的增加呈顯著的負相關[7]。故Hpa被認為是多種腫瘤惡性浸潤和轉移的重要標志。

表1 NSCLC組織中 HPa表達與臨床病理特征間的關系

本研究結果提示 NSCLC肝素酶轉錄水平和翻譯水平的表達均非常顯著地高于癌旁組織;肝素酶表達與 NSCLC的組織學類型、淋巴轉移、TNM臨床分期和腫瘤分化程度有密切關系,而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無明顯關系。肝素酶轉錄水平和翻譯水平表達率在淋巴結轉移組、Ⅲ期+Ⅳ期組、低分化組分別顯著高于無淋巴結轉移組、Ⅰ期 +Ⅱ期組、中高分化組。提示肝素酶表達與 NSCLC的組織學類型、淋巴結轉移、TNM臨床分期和較低腫瘤分化程度呈正相關,由此可以推測肝素酶可能與 NSCLC的轉移潛力有關,研究還表明肝素酶與 NSCLC的分化程度密切相關,肝素酶表達水平越高 NSCLC的惡性程度越高。

綜上所述,Hpa可作為非小細胞肺癌轉移、復發(fā)的重要指標之一,有必要進行進一步研究,從而揭示其作用機制和應用價值。

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6 Maxhimer JB,Quiros RM,Stewart R,et al.Heparanase-1 expression is associated with the metastatic potential obreast cancer.Surgery,2002,132：326-333.

7 Koliopanos A,Friess H,Kleeff J,et al.Heparanase expression in primary and metastatic pancreatic cancer.Cancer Res,2001,61：4655-4659.

Exp ression and clinical significance of heparanase in the tissueo fhuman non-small cell lung cancer

SONG Yongbin,WANG Zhikang,LI U Lijun,et al.Department of Thoracic Surgery,Hebei Provincial People's Hospital,Shijiazhuang 050051,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of heparanase in the tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC)and the relationship between heparanaseexpression and clinical pathological features.Methods Expression of heparanase gene in 52 resected surgically NSCLC tissues and ad jacent normal lung tissues were detected by RT-PCR assay and immunohistochemical staining.Then the relationship between heparanase exp ression and clinical pathological features of NSCLC was analyzed.Resu lts The expression of heparanase gene and protein was observed in NSCLC tissues.Heparanase protein was located in tumor cell cytop lasm and/or cellmembrane.The rate of heparanasemRNA expression in cancer tissues(39/52,75%)was significantly higher than that(11/52,21.2%)in ad jacent normal tissues(P＜0.01).The rate of heparanase protein expression in cancer tissues(36/52,69.2%)was significantly higher than that(9/52,17.3%)in adjacent normal tissues(P＜0.01).Heparanase exp ression was correlated to histology,lymphatic metastasis and TNM stages(P＜0.01).Conclution Heparanase is overexpressed in cancerous tissues,as compared with adjacent tissues.The expression of heparanase is correlated tometastasis and developmentof NSCLC.

non-small cell lung cancer;heparanase;lymphatic metastasis;neop lasm staging

R 734.2

A

1002-7386(2010)06-0653-03

050051 石家莊市,河北省人民醫(yī)院胸外科

2010-01-31)