芽孢桿菌在沼蝦養(yǎng)殖水體中益水作用的研究

張 云 寧麗軍 謝曉暉 張妮靜

目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，粗放式養(yǎng)殖正逐漸被半集約化和集約化養(yǎng)殖所取代，高密度、工廠化的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式在世界各地的蓬勃發(fā)展很大程度上滿足了人們對水產(chǎn)品的需求，解決了自然漁業(yè)資源相對短缺的矛盾，但同時水體環(huán)境也在發(fā)展過程中日益惡化，pH值不穩(wěn)定，氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽、重金屬含量超標(biāo)，而水體中病原微生物的數(shù)量與氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽的濃度直接相關(guān)（余林娟，2004），像細(xì)菌性敗血癥等疾病的發(fā)生條件之一就是水體這些指標(biāo)明顯偏離正常值。同時，為了控制病害超量使用水產(chǎn)藥物，甚至使用違禁藥物，導(dǎo)致水產(chǎn)品安全性大大降低，形成惡性循環(huán)。為了保護(hù)漁業(yè)生態(tài)環(huán)境，提高可持續(xù)發(fā)展的效益，應(yīng)用微生態(tài)制劑全程控制水體指標(biāo)以保障安全生產(chǎn)已經(jīng)成為許多養(yǎng)殖戶的必然選擇，尤其是對于養(yǎng)蝦業(yè)，利潤相對較高但投入大、風(fēng)險大，一旦發(fā)病，后果相當(dāng)嚴(yán)重，如何調(diào)養(yǎng)水質(zhì)已經(jīng)成為困擾養(yǎng)蝦業(yè)的一個關(guān)鍵問題。微生物對疾病的預(yù)防和促進(jìn)蝦體生長的作用已經(jīng)通過多年的養(yǎng)殖實踐充分體現(xiàn)出來了（李勤生，1995），而芽孢桿菌的功用更是引起了水產(chǎn)學(xué)界的關(guān)注，這種益生菌是微生態(tài)制劑中常用的一種對養(yǎng)殖動物無毒、無害的細(xì)菌，在無公害水產(chǎn)品的生產(chǎn)、開發(fā)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。芽孢桿菌在水中增殖后產(chǎn)生的許多胞外酶能把養(yǎng)殖水體、底泥中的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等有機質(zhì)分解，從而達(dá)到維持養(yǎng)殖水生動物消化道微生物的生態(tài)平衡，降低養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化和減少病菌滋生，增強免疫力的作用。本文通過對江蘇高郵地區(qū)養(yǎng)蝦大棚不同時期提取的水樣所做的多組分析試驗，詳細(xì)分析了芽孢桿菌在蝦類養(yǎng)殖水體中的重要作用，而在生產(chǎn)中正是靠這些產(chǎn)品的應(yīng)用才使輪蟲、小球藻等生物餌料大量繁殖，藻相和菌相維持正常，減少使用一些副作用較大的農(nóng)藥和抗生素，極大改善了漁業(yè)的產(chǎn)品品質(zhì)，從而提高了我國水產(chǎn)品在國際市場上的競爭力（王彥波等，2003）。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選擇江蘇高郵司徒鎮(zhèn)相鄰且情況基本相同的兩養(yǎng)殖池(1#和2#)，1#養(yǎng)蝦池作為試驗池（每隔5 d按量使用1次芽孢桿菌），2#作為對照池（不使用芽孢桿菌），分別在鍋爐苗、大棚苗和大水苗放養(yǎng)后的3個晴天上午9:00定點0.5 m水深采取兩池水樣，并且標(biāo)定序號1 h內(nèi)進(jìn)行試驗，在整個試驗期間兩池保持相似的管理條件，且沒有使用消毒劑，采樣的同時檢測池水透明度，所有測定均重復(fù)3次取平均值。

1.2 材料與器材

試驗用粉劑濃縮芽孢桿菌（活菌含量5×109個/g，使用劑量200 g/（畝·m）由上海四季生物科技有限公司提供，氨氮顯色劑、硫化氫顯色劑及亞硝酸鹽顯色劑在實驗室配制。

智能型水質(zhì)分析儀（MR220，南京特安科貿(mào)有限公司生產(chǎn)）；顯微鏡（njf1-xs-212，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司生產(chǎn)）；血球計數(shù)板（71103，鹽城市恒泰玻璃儀器廠生產(chǎn)）；塞氏盤（自制）。

1.3 試驗方法

1.3.1 水體透明度的測定（塞氏盤法）

1.3.1.1 塞氏盤的制作

用鐵皮剪刀剪取直徑20 cm的圓白鐵皮一塊作為圓盤，中心打一個3 mm的孔。用銼刀沿鐵盤外沿銼去快口和毛刺。在盤的一面過鐵盤圓心畫2條相互垂直的直徑，間隔涂上白漆和黑漆。等漆干后，把一頭扎有重物的繩子從未涂漆一面穿過圓盤中心孔，調(diào)整重物位置，使圓盤懸空時呈水平狀態(tài)。然后在繩子貼近盤面處打一個結(jié)，使重物與圓盤成為一體。用黑漆在繩子上涂刷。以1 cm為基本單位作為長度標(biāo)記，標(biāo)記段取50 cm左右。

1.3.1.2 水體透明度的測定

采集水樣前在兩個養(yǎng)殖池各選擇3處無直射光照射處作為測定對象，將塞氏盤緩緩放入水中（注意觀察長度標(biāo)記）。當(dāng)圓盤下沉到恰好看不見盤面白色時，記錄水面以下繩子長度。此數(shù)據(jù)即代表了水體透明度。測3次以求準(zhǔn)確數(shù)值，把結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

1.3.2 樣品的處理及標(biāo)號

將樣品分別經(jīng)粗過濾后，用小燒杯各量取15 ml，按時間及測量項目的不同依次標(biāo)號，如3月12日所采水樣全部標(biāo)為1號，3月23號所采水樣全部標(biāo)為2號，依此類推，標(biāo)記明確試驗組與對照組。

1.3.3 氨氮的測定

1.3.3.1 純水標(biāo)定

在水質(zhì)分析儀的氨氮測量位置上放入裝滿2/3純水的氨氮比色皿，在主工作界面下，選擇標(biāo)定氨氮選項，進(jìn)行純水標(biāo)定并且儲存數(shù)據(jù)。

1.3.3.2 氨氮測定

用小燒杯量取15 ml的水樣，用膠頭滴管向水中加入氨氮顯色劑0.8 ml。10 min以后，水樣變黃并且產(chǎn)生一些絮狀沉淀，經(jīng)濾紙過濾后將溶液倒入比色皿內(nèi)約2/3處，用擦鏡紙吸干比色皿透光處的水珠后放到水質(zhì)分析儀氨氮測試位置進(jìn)行測量（侯樹宇，2004）。重復(fù)以上步驟，每個樣品測量3次。

1.3.4 硫化氫的測定

1.3.4.1 純水標(biāo)定

采用1.3.3.1節(jié)類似的方法。

1.3.4.2 硫化氫測定

將小燒杯里的15 ml水樣先用膠頭滴管加入10 ml硫化氫顯色劑一號，再加入1 ml硫化氫顯色劑二號，混合均勻后靜置5 min后倒入比色皿內(nèi)約2/3處再將比色皿擦拭干凈后放到硫化氫測試位置開始測量。重復(fù)以上步驟，每個樣品測量3次。

1.3.5 亞硝酸鹽的測定

1.3.5.1 純水標(biāo)定

采用1.3.3.1節(jié)類似的方法。

1.3.5.2 亞硝酸鹽測定

將小燒杯內(nèi)的水樣滴入1 ml配制好的亞硝酸鹽顯色劑，混合并靜置5 min后倒入比色皿內(nèi)約2/3處，擦干水跡后將比色皿放到亞硝酸鹽測試位置重復(fù)以上步驟，每個樣品測量3次。

1.3.6 血球計數(shù)板測量樣品中有益藻及有害藻的數(shù)量

將血球計數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央的計數(shù)室上加蓋專用的厚玻片，將樣品用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣，使溶液緩緩滲入，多余的水分用吸水紙吸取，稍待片刻，使藻類全部沉降到血球計數(shù)室內(nèi)，計數(shù)時，使用16格×25格規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，數(shù)左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的藻數(shù)（李卓佳，1998）（小球藻、螺旋藻等有益藻及裸藻、藍(lán)藻有害藻分別計數(shù)）。當(dāng)遇到位于大格線上的藻，一般只計數(shù)大方格的上方和右方線上的(或只計數(shù)下方和左方線上的)。對每個樣品計數(shù)3次取其平均值，按下列公式計算每1 ml樣品中所含的藻的個數(shù)。

16格×25格的血球計數(shù)板計算公式：

有益（有害）藻量（個/ml）=100小格內(nèi)有益（有害）藻的數(shù)量/100×400×104。式中：400 指所有小格的總數(shù)；104指每個小格體積是0.1 mm3。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 11.5軟件及excel2003軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體透明度的變化曲線（見圖1）

圖1 水樣使用芽孢桿菌前后平均透明度對比

透明度是反映養(yǎng)殖系統(tǒng)水質(zhì)好壞的一個重要指標(biāo)（張慶等，1999），一般來說，養(yǎng)殖蝦池水體的透明度前中期以30～35 cm為宜，兩池水樣在這時期大體上都沒有什么問題，但試驗結(jié)果表明，水體透明度是隨著養(yǎng)殖時間的延長有不斷下降的趨勢，在使用了芽孢桿菌之后試驗組與對照組比較，變化幅度依次是－2.3%、－5.5%、+3.9%、－5.4%、－3.1%、－6.5%，對照組透明度基本都有明顯的下降，尤其是在靠近中后期，或者水體中突然在短時間富營養(yǎng)化的時候，芽孢桿菌能維持透明度穩(wěn)定而不至于使得養(yǎng)殖水發(fā)生渾濁或水華。由t檢驗可以知道，所測數(shù)據(jù)整體上說|t|=1.923＜t0.05(6)，則 P＞0.05，表明試驗組與對照組透明度差異不顯著，這主要是由于在第3 d天氣變化導(dǎo)致芽孢桿菌作用效果減弱了，同時，水體溶氧等其它理化因子和浮游生物品種產(chǎn)生很大變化以致藻類大量死亡所致，對試驗結(jié)果分析無礙。當(dāng)去掉這一數(shù)值后，t值達(dá)到 11.2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 t0.01(5)，差異極顯著（P＜0.01）。研究曲線同時說明，使用芽孢桿菌后水體的透明度整體上是在穩(wěn)定中緩慢下降，這一點是非常重要的，沒有使用芽孢桿菌的對照組透明度變化幅度明顯大于試驗組，在實際生產(chǎn)中，水質(zhì)指標(biāo)良好，穩(wěn)定是第一位的，并不是透明度越大，提高透明度越快越好（劉春潮，1996），盲目增大透明度的行為會造成懸浮微生物少，水體自凈能力弱，氨氮或亞硝酸鹽含量過高，蝦更易生病。

2.2 氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽的變化曲線

分別將9 d采集的水樣進(jìn)行分析得到數(shù)據(jù)變化曲線，見圖 2、圖 3、圖 4。

圖2 水樣使用芽孢桿菌前后氨氮平均濃度對比

圖3 水樣使用芽孢桿菌前后硫化氫平均濃度對比

圖4 水樣使用芽孢桿菌前后亞硝酸鹽平均濃度對比

氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮含量之和稱為“無機氮含量”（辛福言等，2002）。從圖2、圖3、圖4可以看出，整個養(yǎng)殖周期內(nèi)，養(yǎng)殖蝦池水體中無機氮含量變化較大，而且總體都呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。同時，試驗組與對照組相比變化顯著，氨氮的下降幅度分別是 6.7%、－2.9%、16.5%、18.9%、11.3%、－3.7%、8.5%、7.6%、21.9%，硫化氫分別為 44.4%、－8.1%、15.25%、20%、8.8%、14.7%、13.2%、25.7%，28.4%，亞硝酸鹽分別為 6.1%、15.5%、19.1%、－1.2%、17.5%、－14.9%、2.6%、9.9%、8.9%。在整個養(yǎng)殖期間，水體的氨氮值在0.16～0.32變化，統(tǒng)計分析表明，養(yǎng)殖40 d后試驗組相對于對照組的氨氮濃度減少率為10.6%，對照組氨氮濃度與試驗組經(jīng)t檢驗，t=3.25小于 t0.01(9)，大于 t0.05(9)，因此 0.01＜P＜0.05，說明試驗組與對照組在使用芽孢桿菌后效果比較明顯，由于前中期取樣沒到氨氮高發(fā)期，只能部分代表芽孢桿菌的效果。試驗組和對照組氨氮和硫化氫濃度在4號樣品稍增后顯著降低是因施肥過多、微生物分解不足導(dǎo)致，同時芽孢桿菌在養(yǎng)殖水體中繁殖為優(yōu)勢菌群需要一段時間（李健，2001）。亞硝酸鹽對照組濃度一直快速上并維持在較高濃度趨勢，而試驗組濃度開始略有升高，而后相對下降，幅度逐漸增加，在養(yǎng)殖中期仍能保持正常水平，亞硝酸鹽濃度相對于對照組減少率為11.6%，芽孢桿菌分解了底質(zhì)沉積物，減少氧氣消耗，促進(jìn)了有益微生物的繁殖（陳秋紅等，2004）。從圖3可以看出，養(yǎng)殖池中硫化氫的變化趨勢都有一個由低到高的階段，體現(xiàn)了污染物在養(yǎng)殖池中的積累過程。對照組的硫化氫含量一直處于顯著升高的狀態(tài)，而試驗組是緩緩升高且最高值仍低于養(yǎng)殖動物最適生長標(biāo)準(zhǔn)。試驗組相對于對照組的硫化氫減少率為48.4%，對照組與試驗組經(jīng)t檢驗，t=2.689大于t0.05(9)，小于 t0.01(9)，因此 0.01＜P＜0.05，表明試驗組與對照組相比差異顯著，如果只是從中期數(shù)據(jù)來看這樣的結(jié)果是有較大誤差的，時間越長水體惡化越嚴(yán)重，芽孢桿菌發(fā)揮作用的空間越大，差異不是極顯著來自前期相近數(shù)據(jù)的存在。這些數(shù)據(jù)整體表明芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽的去除有明顯的功效，使用之后對于蝦池水體環(huán)境有顯著改良。

2.3 水樣中有益（有害）藻數(shù)量對比曲線（見圖5）

圖5 水樣使用芽孢桿菌前后有益、有害藻數(shù)量對比

從圖5中能夠直觀的看出芽孢桿菌對水體藻類種類和數(shù)量的影響，與對照組比較，試驗組小球藻、螺旋藻等有益藻保持較高水平，同時芽孢桿菌作用水體以后對藍(lán)藻等有害藻有一定抑制作用，雖然沒有定性檢測，但是可以觀察分析出來。試驗中還觀察到芽孢桿菌對防治養(yǎng)殖水體的富營養(yǎng)化具有一定作用，其作用原因可能是芽孢桿菌降低了水中C、N、P等元素的含量，使得藍(lán)藻等因缺乏營養(yǎng)元素而無法大量生長繁殖，從而達(dá)到了控制水中有害藻類的目的。

3 討論

本次試驗是從實際的養(yǎng)蝦池里獲取水樣，通過塞氏盤法、分光光度法和血細(xì)胞平板法，對比測定使用芽孢桿菌與否的水體透明度、氨氮濃度、硫化氫濃度、亞硝酸鹽濃度、有益（有害）藻數(shù)量等數(shù)據(jù)，經(jīng)過總結(jié)之后可以得到明顯的結(jié)論：芽孢桿菌能有效提高養(yǎng)殖蝦池水體透明度，減少氨氮、亞硝氮、硫化氫、藍(lán)藻等有毒、有害物質(zhì)對羅氏沼蝦的危害，促進(jìn)浮游生物生長，營造出適宜羅氏沼蝦健康成長的水色。

目前，水產(chǎn)領(lǐng)域?qū)＜覍ρ挎邨U菌的作用已經(jīng)做了很多研究。沈錦玉 (2006)在養(yǎng)魚水體使用芽孢桿菌B115制劑后，對養(yǎng)殖水體的溶氧和pH值無明顯影響，但對氨氮、亞硝酸鹽和硫化物均有大幅度降低，水體透明度明顯增加。尹文林(2006)在蟹池和魚池中分別加入芽孢桿菌作為水質(zhì)改良劑發(fā)現(xiàn)，其對池塘氨氮、亞硝酸鹽氮和硫化物有明顯的降解作用，最大降解峰值出現(xiàn)在3～4 d，有效時間持續(xù)超過7 d。湯寶貴等(2007)研究也表明，芽孢桿菌能明顯凈化水質(zhì)，降低魚池和鱉池中的COD、亞硝酸氮和氨氮。但到目前為止還沒有專門針對羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程使用芽孢桿菌狀況的研究，由于羅氏沼蝦與別的養(yǎng)殖對象在生活習(xí)性和日常管理方面存在一些明顯差異，所以只要能夠使養(yǎng)蝦的水質(zhì)維持指標(biāo)正常，水色優(yōu)良，藻類、菌類、浮游動物動態(tài)平衡，就能在很大程度上獲得豐收的保證，而本次試驗結(jié)果證明，芽孢桿菌正好能達(dá)到這樣的目的，在整個試驗過程中試驗組的羅氏沼蝦身體健壯，活力旺盛，腸道飽滿，而對照組的蝦則出現(xiàn)了不同程度的厭食、偷死等情況。因此，進(jìn)一步研究芽孢桿菌在羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體中益水作用就顯得極為關(guān)鍵和必要。

從整個養(yǎng)殖周期來看，在鍋爐苗期間，總體上投餌很少，水體溶氧充分，藻相及菌相良好，透明度維持在較高水平，各種指標(biāo)都會維持正常，但高密度長期養(yǎng)殖沼蝦會造成大量的排泄物、殘餌等有機物積累于水體，使池底表層中氧化層變薄，同時微生物缺乏導(dǎo)致分解不足，特別是氣溫變高時，水體中釋放出了大量的氨、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)，造成蝦池生物比例失調(diào)，水變渾發(fā)黑，從而影響沼蝦的生長發(fā)育，引發(fā)蝦體患病（Ho It JG，1994）。具體來說，沼蝦水體中透明度隨時間的延長在不斷下降，氨氮和亞硝酸鹽的含量都有上升趨勢，但總體是呈現(xiàn)一個緩慢的過程。氨氮是沼蝦池污染的重要因素之一，其危害的具體表現(xiàn)為：大量消耗水體溶解氧，使水體缺氧，與氯作用生成氯胺，還會加速水體的富營養(yǎng)化過程，誘發(fā)爆發(fā)性流行病或直接對沼蝦產(chǎn)生危害，造成沼蝦的大量死亡。氨氮的含量在沼蝦養(yǎng)殖20～25 d時出現(xiàn)小峰值，亞硝酸鹽的含量在30～35 d時才出現(xiàn)峰值，這說明肥水后對照組散失在水體中的蛋白質(zhì)等有機氮不是立即被微生物分解脫氨的，而是積累到一定程度，待水體中異養(yǎng)菌大量繁殖到一定數(shù)量時，才被大量分解產(chǎn)生氨，造成水體中氨含量出現(xiàn)升高，而試驗組由于芽孢桿菌的分解轉(zhuǎn)化使得氨的含量升高并不明顯，同理對照組亞硝酸鹽的峰值比氨氮的峰值約延遲10 d，說明水體中的氮循環(huán)速度較慢，養(yǎng)殖環(huán)境中有機氮并未被及時去除，亞硝酸鹽對沼蝦具有很強的毒性，能把血紅蛋白中的二價鐵氧化為三價鐵，使得血紅蛋白中的亞硝酸鹽還對沼蝦的器官造成損害，嚴(yán)重影響沼蝦的生長發(fā)育（Boyd，2000），使用芽孢桿菌的試驗組亞硝酸鹽仍然處于比較正常水平，但不會影響蝦苗的生長。在養(yǎng)殖中期，由于水體有機物過多，局部供氧不足導(dǎo)致硫化氫開始增加至危險水平，芽孢桿菌明顯抑制了增長的趨勢，同時由于水體環(huán)境的改良，小球藻等有益藻數(shù)量也得到顯著增加，蝦苗所需的生物餌料保持充足。因此，在高密度的沼蝦養(yǎng)殖過程中，適時加入芽孢桿菌等微生物制劑，能加快水體的物質(zhì)循環(huán)，降低養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽等突然變化增加的風(fēng)險，經(jīng)常使用蝦塘水體能保持穩(wěn)定，水既不太“肥”也不易變“清”，水環(huán)境長時間處于良好水平。

在羅氏沼蝦的實際養(yǎng)殖過程中使用芽孢桿菌是非常安全的，只有當(dāng)芽孢桿菌濃度超過800 mg/l，才會因為菌體耗氧導(dǎo)致羅氏沼蝦缺氧而死，因此，作為水質(zhì)改良劑需視蝦池水質(zhì)情況每7 d潑灑全池1次，使用后及時開增氧機保證充足氧氣，同時芽孢桿菌屬細(xì)菌、消毒劑對其有殺滅和抑制作用，要在蝦池消毒5～7 d后方可使用。芽孢桿菌的用量可根據(jù)實際水體大小、水色、底質(zhì)好壞、水質(zhì)因子超標(biāo)與否等來靈活掌握用量，在養(yǎng)殖中后期，用量可適當(dāng)加大。芽孢桿菌需要定期施用，保持其在羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體中擁有穩(wěn)定的數(shù)量，才能收到滿意的效果，獲取最大的效益。

綜上所述，芽孢桿菌對養(yǎng)殖沼蝦的水體凈化有一定功效，能有效地降低水中氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽含量，通過細(xì)菌的共生或互生作用，而迅速降解蝦池中的有害成分。雖然芽孢桿菌不能總是沼蝦池里的優(yōu)勢菌群，但是可以通過定期或不定期地使用高密度的高效菌液，使其在養(yǎng)蝦水體中形成優(yōu)勢菌群。芽孢桿菌對沼蝦池的凈化作用需要對水域環(huán)境有一個適應(yīng)過程（Austin，2000），如養(yǎng)殖戶堅持使用會取得理想的養(yǎng)殖效果。