單用A23187誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞成樹突狀細(xì)胞及其介導(dǎo)耐藥腫瘤細(xì)胞殺傷的實(shí)驗(yàn)研究

王寶中 王麗萍 王彥文 張麗華 孫桂明

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

MCF-7/ADM(耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞系)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所惠贈(zèng)。A23187為SIGMA公司產(chǎn)品；rhGM-CSF為廈門特寶公司產(chǎn)品；rhIL-4、rhTNF-a為STRATHMANN BIOTECH GMBH產(chǎn)品；RPMI1640干粉(美國(guó)GIBCOBRL)；MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自SIGMA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.2.1 鈣離子載體(A23187)誘導(dǎo)單核細(xì)胞

1.2.2 聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞

1.2.3 收獲樹突狀細(xì)胞的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué) 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并攝影。

1.2.3.2 免疫表型 用于細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè)的單克隆抗體分別為PE結(jié)合的鼠抗人CD1a、HLA-DR、CD83、CD80單抗及CD86單抗。

1.2.3.3 DCs激活T淋巴細(xì)胞

DC誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生:參考文獻(xiàn)[4]T淋巴細(xì)胞與負(fù)載特異性抗原DC按1:100效靶比混合培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞即為CTL。

1.2.3.4 MTT殺傷試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[4]并略作改動(dòng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的特點(diǎn)

培養(yǎng)24小時(shí)后，光鏡下見CK組誘導(dǎo)細(xì)胞體積增大并增殖，而A23187組除上述改變外，少數(shù)細(xì)胞已可見2～3個(gè)刺狀突起。48小時(shí)后兩組均見明顯多形性，CK組部分細(xì)胞也可見少許突起。培養(yǎng)3天后，具有刺狀突起的細(xì)胞數(shù)量增多，且突起更為明顯，培養(yǎng)至7天時(shí)，多數(shù)細(xì)胞呈典型的DC形態(tài)。見圖1、2。

2.2 不同誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)DC速度的比較

不同時(shí)間各組細(xì)胞因子對(duì)K562-DC的誘導(dǎo)率見表1。結(jié)果表明A23187組誘導(dǎo)率在3天，7天時(shí)均明顯高于CK組(P均＜0.05)，且A23187組3天時(shí)的誘導(dǎo)率已明顯高于CK組7天時(shí)的誘導(dǎo)率(P均＜0.01)。

2.3 誘生DCs介導(dǎo)CTL對(duì)耐藥細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

誘生DC介導(dǎo)的CTL(DC活化CTL的比例為1:100)對(duì)靶細(xì)胞殺傷率(MCF-7/ADM)的比較見表2。從表中數(shù)值各組DC均能激活異基因淋巴細(xì)胞并介導(dǎo)其對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞殺傷，且隨效靶比的增高，殺傷率也升高；且兩組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

本課題通過(guò)聯(lián)用GM-CSF、IL-4和TNF-α與A23187成功的誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞成DC，并通過(guò)對(duì)二者的比較發(fā)現(xiàn)鈣離子載體能更快速有效地誘導(dǎo)出功能活性的樹突狀細(xì)胞。在應(yīng)用180～275ng低濃度的A23187時(shí)，PBMC能在24小時(shí)左右即可有部分細(xì)胞呈現(xiàn)出DCs的形態(tài)，72小時(shí)誘導(dǎo)率達(dá)60%左右，明顯高于聯(lián)用細(xì)胞因子組；且培養(yǎng)3天后各種表面標(biāo)志的表達(dá)均與細(xì)胞因子培養(yǎng)7天組相同。這均提示與聯(lián)合細(xì)胞因子組相比，A23187能更快速有效地將PBMC細(xì)胞誘導(dǎo)成為DCs。為了進(jìn)一步證明此種方法誘導(dǎo)DC的可靠性，我們又從表型及功能方面進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)A23187誘生的DCs具有較細(xì)胞因子組相似或更強(qiáng)的刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖的能力，而且證實(shí)該種來(lái)源的DC介導(dǎo)了CTL對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的殺傷作用。

表1 不同時(shí)間各組細(xì)胞因子DC的誘導(dǎo)率比較()

表1 不同時(shí)間各組細(xì)胞因子DC的誘導(dǎo)率比較()

注:實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

組別誘導(dǎo)率3d 7d A23187組 58.8±18.6 24.5±15.1 CK組 66.5±11.4 48.5±15.3

表2 不同因子誘生DC介導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)()

表2 不同因子誘生DC介導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)()

注:實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

組別 效靶比10:1 20:1 40:1 80:1 A23187-DC 12.75±2.87 21.25±9.64 32.44±10.27 43.78±12.19 CK-DC 9.59±8.47 24.04±3.43 28.82±13.78 48.25±15.56

圖1 A23187誘導(dǎo)的PBMCDC(×400倍)

圖2 聯(lián)合CK誘導(dǎo)的PBMCDC(×400倍)

[1]Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immuneogenicity[J].Annu Rev Immunol,1991,9:271-296.

[2]St.Louis DC,Woodcock JB,Fransozo G,et al.Evidence for distinct intracellular signling pathways in CD34(+)progenitor to dendritic cell differentiation from a human cell model[J].J Immun,1999,162:3237-3248.

[3]孟冬梅,趙春亭,吳少玲,等.急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞來(lái)源的樹突細(xì)胞的誘導(dǎo)及功能研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2004,12:625-631.

[4]趙春亭,王寶中,孟冬梅,等.單用A23187快速誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化成樹突細(xì)胞的研究[J].中華血液學(xué)雜志,2005,26:408-412.