延遲血漿懸浮匯集白膜制備血小板的探討

趙曉霞 沈莉 李建民 張愛紅 梁曉虎

通過白膜分離的方法制備濃縮血小板在歐洲得到廣泛的實(shí)踐[1]。為節(jié)約和充分利用血液資源,輸血事業(yè)發(fā)達(dá)的歐洲14國,成人劑量血小板(adult platelet doses,APD)44.1%是用BC-PC匯集的,7.2%是用 PRP-PC匯集的,48.6%是機(jī)采的[2]。出于不浪費(fèi)寶貴血液資源和進(jìn)一步保證安全輸血的目的,筆者借鑒國外先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和技術(shù),采用延遲血漿來懸浮白膜并制備血小板。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將匯集白膜單-延遲血漿制備的 30例濃縮血小板作為實(shí)驗(yàn)組,將用Baxter CS-3000 Plus采集的血小板 30例為對(duì)照組。

1.2 材料 400 ml采血四聯(lián)袋(廣州華南醫(yī)療用品有限公司),Beckman J-6B型離心機(jī)(美國制造)、r=25 cm,TSCD 201A無菌導(dǎo)管連接器(日本制造),Beckman counter AC.T5.diff-2血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國制造),PF型白細(xì)胞過濾器(南京雙威生物制品有限公司),Nagotte Chember白細(xì)胞計(jì)數(shù)板。

1.3 方法

1.3.1 白膜的提取方法：將四聯(lián)袋采集的 1～3 h內(nèi) 400m l全血以 2 918 g,14 m in,22℃為離心條件進(jìn)行離心,離心畢取出置于血漿擠壓器中,將上層血漿全部分入第一個(gè)轉(zhuǎn)移袋中并用止血鉗夾好;將白膜及相鄰的紅細(xì)胞約 25～35 g擠入第二個(gè)轉(zhuǎn)移袋中并用止血鉗夾好;將紅細(xì)胞保存添加劑加入母袋中并用止血鉗夾好;分別熱合后余下白膜袋備用。

1.3.2 延遲血漿的融化方法：將冷凍儲(chǔ)存至少在 112 d以上(不超過有效保存期),與白膜同型并經(jīng)再次檢驗(yàn)合格的 200～250m l延遲血漿(獻(xiàn)血后的合格血漿經(jīng)冷凍暫時(shí)不用,待同一獻(xiàn)血者再次獻(xiàn)血后并經(jīng)檢驗(yàn)無異常后,前期的冷凍血漿再行應(yīng)用),置于 37℃恒溫水浴箱中進(jìn)行融化,融化后的血漿用于懸浮匯集白膜。

1.3.3 匯集白膜及懸浮血小板方法：將檢驗(yàn)合格后同型備用白膜 6份通過無菌導(dǎo)管連接匯集于容量為 450～500ml的二聯(lián)袋中,將融化后的血漿亦通過無菌連接加入?yún)R集有白膜的袋子中,輕輕混勻后在室溫下靜置 2 h。

1.3.4 濃縮血小板的分離及過濾方法：將靜置后含有混懸液的二聯(lián)袋以 260 g,10min,22℃為離心條件進(jìn)行離心,離心畢取出置于血漿擠壓器中,將上層血漿即濃縮血小板全部分入另一個(gè)轉(zhuǎn)移袋中并用止血鉗夾好;將含有濃縮血小板袋子通過無菌連接與 PF型白細(xì)胞過濾器進(jìn)行連接,連接畢按過濾器說明書的要求進(jìn)行血小板過濾,過濾完成后熱合下含有血小板的袋子,此即為制備的濃縮血小板制劑。

1.3.5 血小板計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞混入量的檢測(cè)方法：將制備的濃縮血小板混勻后取樣,按Beckman counter血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀說明書提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 白細(xì)胞污染量的檢測(cè)方法：未經(jīng)過濾血小板的白細(xì)胞污染量用 Beckman counter血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè),過濾后血小板中的白細(xì)胞污染量按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 本實(shí)驗(yàn)血小板質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：參照文獻(xiàn)[4]單采血小板(每袋)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2組制備的血小板質(zhì)量比較情況見表 1;實(shí)驗(yàn)組制備的濃縮血小板過濾前、后白細(xì)胞污染及血小板損失情況見表 2。

3 討論

從表 1可見,本實(shí)驗(yàn)方法血小板質(zhì)量,除血小板計(jì)數(shù)較對(duì)照組偏低外,白細(xì)胞污染量及紅細(xì)胞混入量均優(yōu)于對(duì)照組,可達(dá)到單采血小板(每袋)國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);血小板中白細(xì)胞混入量可達(dá)到用于預(yù)防非溶血性輸血發(fā)熱反應(yīng)的要求,但不足以用于預(yù)防 CMV感染或 HLA同種免疫的要求。目前國外白膜法制備的血小板多由 4～6份同型白膜(每份白膜含血漿 30 ml左右)匯集而成。國外文獻(xiàn)報(bào)道通過白膜法匯集 5 U血液平均可獲得血小板量達(dá) 4.2×1011[5]。本實(shí)驗(yàn)血小板含量較國外文獻(xiàn)報(bào)道的為低。究其原因,筆者認(rèn)為,一是不排除血液本身血小板含量的差別,二是不排除制備工藝上存在導(dǎo)致血小板損失的地方。

表1 2組制備的血小板質(zhì)量比較情況n=30,±s

表1 2組制備的血小板質(zhì)量比較情況n=30,±s

組別血小板計(jì)數(shù)(×1011)白細(xì)胞污染量(×108)紅細(xì)胞混入量(×109)實(shí)驗(yàn)組 2.73±0.13 0.851±0.032 1.72±0.06對(duì)照組 3.08±0.21 1.012±0.021 3.84±0.14 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表 2 過濾前、后濃縮血小板中白細(xì)胞污染及血小板損失情況n=30,±s

表 2 過濾前、后濃縮血小板中白細(xì)胞污染及血小板損失情況n=30,±s

時(shí)間 白細(xì)胞污染量(×108) 血小板計(jì)數(shù)(×1011)過濾前 0.852±0.031 2.73±0.13過濾后 0.010±0.001 2.51±0.11 P值 ＜0.05 ＜0.05

無論是手工匯集的含多人份血漿及單采的含單人份血漿的血小板,二者無法回避的共同事實(shí)是：都不能避免窗口期感染的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用延遲血漿來重新懸浮血小板以及采用過濾器去除白細(xì)胞,正是出于避免因白細(xì)胞及血漿導(dǎo)致的輸血傳染病的發(fā)生。血漿儲(chǔ)存 112 d以上并經(jīng)再次檢驗(yàn),可避免 HCV、HBV和HIV前期檢驗(yàn)因窗口期導(dǎo)致的誤檢的發(fā)生,進(jìn)一步提高輸血的安全性。從表 2可見,使用過濾器去除血小板中的白細(xì)胞效果明顯,可達(dá)到預(yù)防CMV感染或HLA同種免疫的殘余白細(xì)胞的國家標(biāo)準(zhǔn),但亦可造成不同程度的血小板損失,且血小板損失量不影響治療量的要求。由此可見,用過濾器去除血小板中的白細(xì)胞可大大降低HLA導(dǎo)致的輸注無效的發(fā)生。

1 Silvia Perez-Pujol,Miguel Lozano,Dolores Perea,et al.Effect of holding buffy coats 4 or 18 hours before preparing pooled filtered PLT concentrates in plasma.Transfusion,2004,44：202-209.

2 Scott Murphy.Platelet from pooled buffy coats：an update.Transfusion,2005,45：634-639.

3 Masse M,Naegelen C,Pellegrini N,et al.Validation of a simple methed to count very low white cell concentrations in filter red cells or platelet.Transfusion,1992,32：565-571.

4 衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2000]448號(hào)(衛(wèi)生部文件)《血站基本標(biāo)準(zhǔn)》附件：全血及成分血質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

5 AABB Technical Manual 12-14th Editions.Chapters 8：components from whole blood donationss.167.