糖尿病合并肺結(jié)核患者的轉(zhuǎn)化生長因子 β1與sFas/sFasL的檢測

孫志平 劉建輝 呂翠環(huán)

隨著糖尿病發(fā)病率的增高及結(jié)核病的回潮,糖尿病合并肺結(jié)核的發(fā)病率也在逐年增加。本文觀察糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)、sFas/sFasL和 T淋巴細(xì)胞凋亡的變化,意在探討 TGF-β1、sFas/sFasL系統(tǒng)及 T淋巴細(xì)胞凋亡在糖尿病合并肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展中的作用,為糖尿病合并肺結(jié)核早期干預(yù)治療和判斷病情提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 正常對照組 10例,其中男 7例,女 3例;平均年齡 33歲。均為醫(yī)院查體正常人員,經(jīng)病史、查體、儀器與實(shí)驗(yàn)室檢查排除糖尿病、肺結(jié)核病、冠心病等疾病。肺結(jié)核組 20例,其中男 12例,女 8例;平均年齡 43歲。根據(jù)臨床表現(xiàn),胸片及胸部 CT確診 6例,痰菌檢查確診 14例。糖尿病組 20例,其中男 12例,女 8例;平均年齡 51歲。根據(jù)其空腹血糖、尿糖及糖耐量實(shí)驗(yàn)等確診。糖尿病合并肺結(jié)核組 15例,其中男 9例,女 6例;平均年齡 55歲。根據(jù)其病史、胸部 X線檢查,痰菌檢查確診。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 常規(guī)收集血清,ELISA法測定 TGF-β1及sFas/sFasL含量,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。TGF-β1試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。人類sFas及sFasL ELISA試劑盒,購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。抽取EDTA抗凝血,離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),使用染色緩沖液清洗 3次,加入抗 CD 3-PC7、抗 CD 4-PECy5和抗 CD 8-ECD一起在冰上染色 30m in,清洗 2次并在磷酸鹽緩沖 0.9%氯化鈉溶液重懸浮后,用結(jié)合 PE的 AnnexinV(AV)染色30min,溶解紅細(xì)胞后稀釋和固定,用 Coulter流式細(xì)胞儀分析,每個(gè)樣本分析 50 000個(gè)細(xì)胞,凋亡結(jié)果以陽性細(xì)胞百分率(%)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清 TGF-β1水平檢測結(jié)果顯示,肺結(jié)核、糖尿病和糖尿病合并肺結(jié)核 3組患者血清 TGF-β1水平均明顯高于正常對照組(P＜0.01),糖尿病合并肺結(jié)核患者 TGF-β1含量也明顯高于肺結(jié)核和糖尿病患者(P＜0.01)。見表 1。

2.2 外周血sFas及sFas L水平檢測結(jié)果顯示,肺結(jié)核、糖尿病和糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血 sFas、sFasL含量均明顯高于正常對照組(P＜0.01),糖尿病患者外周血 sFasL含量最高。糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血sFasL含量明顯低于糖尿病患者,若以 1 000 pg/m l為臨界值,糖尿病合并肺結(jié)核 15例患者中,14例sFasL含量＜1 000 pg/ml,診斷糖尿病合并肺結(jié)核的敏感性為 93.3%(14/15),特異性為 90.0%(18/20);20例糖尿病患者中,18例 sFasL含量 ＞1 000 pg/ml,兩者合計(jì)臨床診斷符合率 91.43%(32/35),外周血sFasL水平下降可以作為判斷糖尿病已或?qū)l(fā)生肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。見表 1。

表1 4組血清TGF-β1和sFas/sFas L水平比較±s

表1 4組血清TGF-β1和sFas/sFas L水平比較±s

注：與正常對照組比較,＊P＜0.01;與糖尿病合并肺結(jié)核組比較,#P＜0.01

組別 sFas(ng/m l)sFas L(pg/ml)TGF-β1(ng/m l)正常對照組(n=10) 2.0±0.9 265±44 18±5肺結(jié)核組(n=20) 7.8±1.6＊ 618±106＊ 45±10＊#糖尿病組(n=20) 8.7±2.1＊ 1 468±312＊ 40±11＊#糖尿病合并肺結(jié)核組(n=15) 7.9±1.9＊ 565±200＊ 66±19＊F值 37.00 116.81 48.90 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 外周血T淋巴細(xì)胞的凋亡結(jié)果顯示,患病組外周血 T淋巴細(xì)胞凋亡率均明顯高于正常對照組,其中糖尿病患者 T淋巴細(xì)胞凋亡率最高,見表 2。

表2 4組患者淋巴細(xì)胞凋亡率比較%,±s

表2 4組患者淋巴細(xì)胞凋亡率比較%,±s

注：與正常對照組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01;與糖尿病組比較,△P＜0.05

組別 CD3T淋巴細(xì)胞凋亡率CD4T淋巴細(xì)胞凋亡率CD8T淋巴細(xì)胞凋亡率正常對照組(n=10) 1.0±0.4 1.8±0.6 1.0±0.4肺結(jié)核組 (n=20) 2.6±1.4＊△ 3.2±1.2#△ 1.6±1.4#△糖尿病組 (n=20) 3.2±2.1# 4.7±2.0 2.3±1.8#糖尿病合并肺結(jié)核組(n=15) 4.3±1.8#△ 5.1±1.5#△ 1.4±0.5#△F值 17.14 27.60 9.45 P值 0.000 0.000 0.000

3 討論

研究認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌侵入機(jī)體后,結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸不僅取決于結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和毒力,在很大程度上還取決于機(jī)體的免疫狀態(tài)[1、2]。結(jié)核病患者通常存在免疫功能紊亂,但抗結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫。TGF-β是一類多功能細(xì)胞因子家族,在人體內(nèi),TGF-β1參與炎癥和細(xì)胞的損傷修復(fù)。在結(jié)核病中,TGF-β1主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,它既抑制 T細(xì)胞的反應(yīng),又能使巨噬細(xì)胞失活,可能是結(jié)核病免疫發(fā)病中的一個(gè)關(guān)鍵因素[3]。轉(zhuǎn)化生長因子的過度表達(dá)與T細(xì)胞免疫紊亂有密切關(guān)系,TGF-β1能通過 Fas/FasL系統(tǒng)增強(qiáng)結(jié)核病 T細(xì)胞凋亡并調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的凋亡。TGF-β1還明顯地抑制BCG誘導(dǎo) T細(xì)胞的生長和 IFN-γ的分泌。有研究認(rèn)為：通過 Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的大量活性 T細(xì)胞的丟失可能增加了宿主對結(jié)核菌感染的易感性[4]。揭示其機(jī)制,將對臨床診斷、針對性的免疫治療有深遠(yuǎn)意義。

Fas/FasL系統(tǒng)在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用,糖尿病患者可能由于各種代謝因子刺激誘發(fā)了Fas/FasL信號(hào)系統(tǒng),而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多,其細(xì)胞凋亡增加可明顯降低外周血 T淋巴細(xì)胞的活性及數(shù)量。另外 Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡降低了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中也起著非常關(guān)鍵的作用,尤其活性T淋巴細(xì)胞的凋亡增多直接降低了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能,使結(jié)核分支桿菌免于 T淋巴細(xì)胞的殺傷作用,而結(jié)核分支桿菌感染巨噬細(xì)胞,表面FasL表達(dá)增加,也增加了Fas陽性 T淋巴細(xì)胞的凋亡,減少了被感染巨噬細(xì)胞的凋亡,胞內(nèi)結(jié)核分支桿菌得以逃脫 T淋巴細(xì)胞的殺傷作用,發(fā)生免疫逃逸,使巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分支桿菌得以長期生存,結(jié)核分支桿菌在體內(nèi)長期生存而致病[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示：糖尿病、肺結(jié)核及糖尿病合并肺結(jié)核患者較正常人外周血 TGF-β1及 sFas/sFasL含量均明顯升高,而T淋巴細(xì)胞的凋亡明顯升高。sFasL含量在糖尿病患者明顯升高。糖尿病合并肺結(jié)核后外周血 sFasL含量又明顯下降,提示在糖尿病合并肺結(jié)核后抑制凋亡因子增加,外周血環(huán)境不利于細(xì)胞的凋亡。在這種情況下,因過多的sFas與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表面的 Fas競爭,阻止其介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,結(jié)果使得被感染巨噬細(xì)胞凋亡減少,肺結(jié)核遷延不愈。在糖尿病或糖尿病合并肺結(jié)核患者,T淋巴細(xì)胞的凋亡增加主要系糖尿病自身代謝因素紊亂導(dǎo)致,故sFas的增多并不能明顯減少活性T淋巴細(xì)胞的凋亡[7,8]。這可能是糖尿病合并肺結(jié)核難以治愈的原因之一。

實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血 sFasL含量明顯低于糖尿病組,若以 1 000 pg/ml為臨界值,我們認(rèn)為sFasL含量小于 1 000 pg/m l可作為診斷糖尿病合并肺結(jié)核的敏感性指標(biāo),提示糖尿患者外周血 sFasL水平下降可能是糖尿病易發(fā)肺結(jié)核的機(jī)制之一,作為預(yù)測糖尿病將發(fā)肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),也可作為鑒別糖尿病是否已合并肺結(jié)核的指標(biāo)。

本文研究結(jié)果提示,TGF-β1、Fas/FasL系統(tǒng)和 T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫可能參與了糖尿病并發(fā)肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制,糖尿病并發(fā)肺結(jié)核患者外周血 TGF-β1、sFas/FasL含量和 T淋巴細(xì)胞的凋亡的變化可以用以預(yù)測發(fā)病、判斷病情、估計(jì)預(yù)后,具有重要的臨床價(jià)值,另外外周血sFasL含量可作為鑒別糖尿病是否已合并肺結(jié)核的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)通過揭示其相關(guān)性,探討了糖尿病患者合并肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制及免疫方式,將臨床與基礎(chǔ)學(xué)科、邊緣學(xué)科緊密聯(lián)系,使臨床針對性的免疫治療成為可能。

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