肉中兩種致病菌的雙重PCR檢測(cè)方法的建立

趙燕麗，許 巖，張立鋼，楊秀芹，邵美麗*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

爆發(fā)的食源性疾病案例多數(shù)是由細(xì)菌性致病菌污染食品引起的[1]。單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌是兩種重要的致病菌，其中以對(duì)肉及肉制品的污染最為嚴(yán)重[2]。目前對(duì)致病菌的檢驗(yàn)大多仍沿用傳統(tǒng)的對(duì)殘余食物的細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定方法，操作繁瑣，耗時(shí)耗力，且敏感性也較低[3]。在突發(fā)事件時(shí)，不能滿足檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的要求。近幾年，諸如單增李斯特菌[4-6]、金黃色葡萄球菌[7-9]等致病菌的單重PCR檢測(cè)方法已被建立起來(lái)。但鑒于這些方法只能針對(duì)食品中單一致病菌進(jìn)行檢測(cè)，而食品中往往同時(shí)存在多種致病菌，所以在單重PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展了多重PCR技術(shù)且有了很大進(jìn)展[10]。如趙新等建立了多重PCR對(duì)乳中沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的同時(shí)檢測(cè)方法[11]，王娜等已用多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)水產(chǎn)品中副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的同時(shí)檢測(cè)[12]。然而目前對(duì)肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的同時(shí)檢測(cè)報(bào)道很少。本研究以單增李斯特菌的hly基因，金黃色葡萄球菌的nuc基因?yàn)檠芯繉?duì)象，建立了一種快速、敏感性好、特異性強(qiáng)的雙重PCR方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肉中這兩種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（S.aureus 26003，S.aureus 4086，S.aureus ATCC12598）、單增李斯特菌（L.monocytogenes 54005，L.monocytogenes 54006，L.monocytogenes 54007，L.monocytogenes C53-3，L.monocytogenes ATCC7466）、大腸桿菌（E.coli C8，E.coli A10）、沙門(mén)氏菌（Salmomellae 5217）、志賀氏菌（Shigella 51570）均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院提供。

1.2 待測(cè)樣品

新鮮的豬腹部五花肉來(lái)自于附近超市。

1.3 主要試劑和儀器

TaKaRa TaqTM，DL2000 DNAmarker，梯 度PCR儀均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；DYY-6C型電泳儀由北京市六一儀器廠生產(chǎn)；GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)購(gòu)于上海天能科技有限公司。

1.4 擴(kuò)增的目的基因及引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc（V01281），單增李斯特菌的溶血素O基因hly（AF253320），通過(guò)Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為168、106bp。引物由上海超世生物科技有限公司合成。引物序列:Primer Sa-F 5'TAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAG C 3'，Primer Sa-R 5'ATTTAACCGTATCACCATCA ATCG 3'Primer Lm-F 5'GGGAAATCTGTCTCAGGT GATGT 3'，Primer Lm-R 5'CGATGATTTGAACTT CATCTTTTGC 3'。

1.5 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法及分離鑒定

取用甘油保存的菌液按1%的比例接種于滅菌的含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSBYE）中，37°C恒溫過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液用滅菌生理鹽水10倍梯度稀釋，將最后三個(gè)稀釋度分別均勻涂布于 TSA-YE 平板（200μL·板-1），每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落記數(shù)，取平均值。挑取單個(gè)特征性菌落，采用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌鑒定。

1.6 細(xì)菌DNA的提取

按照1%比例將菌種接種于滅菌的TSB-YE培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)13 h，取菌液1mL按照參考文獻(xiàn)[13]玻璃珠機(jī)械法提取DNA作為模板。

1.7 雙重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

首先在梯度PCR儀上對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳退火溫度后，再對(duì)Mg2+、模板、引物、Taq酶及dNTPs濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)L16（45），進(jìn)而篩選最優(yōu)的PCR反應(yīng)體系。正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

1.8 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

用2%瓊脂糖凝膠分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.9 特異性試驗(yàn)

采用已經(jīng)建立的最優(yōu)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件對(duì)5株單增李斯特菌、3株金黃色葡萄球菌、1株沙門(mén)氏菌、2株大腸桿菌及1株志賀氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)引物和反應(yīng)的特異性。

1.10 敏感性試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌（26003）、單增李斯特菌（54007）及兩種菌的混合菌液，分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，使金黃色葡萄球菌的終濃度為108～100cfu·mL-1，單增李斯特菌的終濃度為108～100cfu·mL-1，混合菌液中兩種菌的終濃度均為107～100cfu·mL-1。然后各取 1mL菌液提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板。采用最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行單重和雙重PCR敏感性檢測(cè)。

1.11 人工模擬肉樣的制備及敏感性檢測(cè)

在人工污染前，樣品按國(guó)標(biāo)法檢測(cè)證實(shí)不含有金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌。取肉樣25 g加入225mL滅菌生理鹽水，勻漿。將過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌（26003）、單增李斯特菌（54007）兩種菌液混合，然后以勻漿液作為稀釋液對(duì)混合菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，使兩種菌的終濃度均為107～100cfu·mL-1。然后各取 1mL 人工污染的勻漿液，按上述1.6所述方法提取DNA，采用最優(yōu)的雙重PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定人工模擬肉樣中兩種菌的最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

2.1.1 退火溫度優(yōu)化

根據(jù)退火溫度應(yīng)比引物Tm值低3～5℃的原則，在梯度PCR儀上選取53.8、54.6、55.5、56.5、57.4、58.4和59.4℃等7個(gè)溫度，進(jìn)行最佳退火溫度的優(yōu)化。結(jié)果顯示，在57.4℃時(shí)，引物之間的相互競(jìng)爭(zhēng)和相互影響最小，擴(kuò)增效果最佳。所以后續(xù)試驗(yàn)的退火溫度均選取57.4℃（見(jiàn)圖1）。

2.1.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)確定的退火溫度，在各反應(yīng)物質(zhì)濃度范圍內(nèi)做一正交試驗(yàn)L16（45），試驗(yàn)方案10為最優(yōu)，結(jié)果如圖2所示。

圖1 退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the annealing temperature

圖2 正交試驗(yàn)優(yōu)化Fig.2 Optimization of orthogonal experiment

通過(guò)退火溫度和L16（45）正交試驗(yàn)的優(yōu)化，篩選出的雙重PCR最佳反應(yīng)體系為:10×Buffer 2.5μL，Mg2+（25 mmol·L-1）2.5μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.4μL，dNTP Mixture（各 2.5 mmol·L-1）1.0μL，模板DNA 1.0μL（0.1μg），上、下游引物（10μmmol·L-1）各1.25μL，用滅菌去離子水補(bǔ)至25μL。其反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、57.4℃退火30 S、72℃延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸7 min，4℃保存。

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖3。

特異性檢測(cè)結(jié)果表明，5株單增李斯特菌和3株金黃色葡萄球菌均出現(xiàn)了目的條帶，而其他非目標(biāo)菌及去離子水陰性對(duì)照均未出現(xiàn)擴(kuò)增，且引物間無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明引物及反應(yīng)均具有較強(qiáng)特異性。

圖3 PCR特異性分析Fig.3 Specific analysis of PCR

2.3 單重PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌分別進(jìn)行敏感性分析，結(jié)果表明，二者的敏感性均為101cfu·mL-1（見(jiàn)圖4）。

2.4 雙重PCR敏感性的測(cè)定

對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進(jìn)行雙重PCR敏感性分析，結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌敏感性為101cfu·mL-1，單增李斯特菌的敏感性為102cfu·mL-1（見(jiàn)圖5）。

2.5 人工模擬肉樣中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌最低檢出限的確定

通過(guò)對(duì)人工模擬肉樣中兩種菌的敏感性進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明，金黃色葡萄球的最低檢出限為102cfu·mL-1，單增李斯特菌的最低檢出限為103cfu·mL-1。

圖4 單重PCR敏感性Fig.4 Sensitivity of single PCR

圖5 雙重PCR的敏感性檢測(cè)Fig.5 Sensitivity of duplex PCR

圖6 人工模擬肉樣中雙重PCR檢測(cè)Fig.6 Duplex PCR detection of artificially simulative meat

3 討論與結(jié)論

PCR擴(kuò)增的最適宜條件，隨引物的不同而不同，因而要建立一個(gè)良好的PCR體系，首先必須探討最適dNTPs、Mg2+、引物、模板和酶的濃度，退火溫度的選擇也直接影響擴(kuò)增效果[14]。金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶的nuc基因已全部定序，通過(guò)nuc基因的特異擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌已被證實(shí)具有很好的特異性[15]。而單增李斯特菌的hly基因也已被證實(shí)具有很好的特異性，且相比inlA基因敏感性較好[16]。本試驗(yàn)以單增李斯特菌的hly基因和金黃色葡萄球菌nuc基因?yàn)榘谢颍紫仍谔荻萈CR儀上確定最佳退火溫度，然后設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L16（45）優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了這兩種菌的雙重PCR檢測(cè)方法，該法具有很好的特異性和敏感性。且通過(guò)單重PCR敏感性和雙重PCR敏感性比較，發(fā)現(xiàn)在雙重PCR中單增李斯特菌的敏感性稍有降低。這一結(jié)果與王娜等用建立的多重PCR方法對(duì)水產(chǎn)品中副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進(jìn)行檢測(cè)的研究結(jié)果相似[12]。這種情況的出現(xiàn)是由于多重PCR反應(yīng)中存在不同基因片段擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)抑制現(xiàn)象，若多對(duì)引物物的比例不合適，或者對(duì)退火溫度的要求不一樣，可能會(huì)導(dǎo)致其中一個(gè)目的基因片段優(yōu)先擴(kuò)增，而另一目的片段的擴(kuò)增受抑制[17]。

進(jìn)一步本試驗(yàn)將建立的雙重PCR檢測(cè)方法應(yīng)用到人工模擬的肉樣中，結(jié)果表明該法對(duì)兩種菌的最低檢測(cè)限分別為金黃色葡萄球菌102cfu·mL-1和單增李斯特菌103cfu·mL-1，其敏感性與王艷君等建立的多重PCR方法檢測(cè)單增李斯特菌的敏感性相當(dāng)，金黃色葡萄球菌的敏感性有所提高[18]。這種敏感性滿足細(xì)菌的濃度為106～108cfu·mL-1或106～108cfu·g-1才能引起食物中毒的條件[19]，也滿足多數(shù)管理?xiàng)l例要求的一些食物中細(xì)菌不得高于102～103cfu·mL-1或 102～103cfu·g-1的要求。此外，肉中金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的最低檢出限均高于細(xì)菌純培養(yǎng)的最低檢測(cè)限，可能是由于PCR反應(yīng)容易受到食品基質(zhì)、培養(yǎng)基成分的干擾。特別是食物成分會(huì)抑制反應(yīng)的順利進(jìn)行。尤其是肉及肉制品中的脂肪、淀粉、膠原蛋白、金屬離子以及其他蛋白質(zhì)等的存在,強(qiáng)烈抑制PCR反應(yīng)，大大降低了檢測(cè)肉及肉制品中的致病菌的敏感性[20]。

本試驗(yàn)建立的雙重PCR檢測(cè)方法與田靜等[21]建立的檢測(cè)肉中金黃色葡萄球菌的PCR方法和李巖等[22]建立的檢測(cè)肉中單增李斯特菌的PCR方法相比，實(shí)現(xiàn)了對(duì)肉中單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌的同時(shí)檢測(cè)，且該法操作簡(jiǎn)便，快速，特異性強(qiáng)，敏感性高，為食品中多種致病菌的同時(shí)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

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