鹿科動物茸角組織Osteopontin基因全長cDNA的克隆及表達(dá)分析

郝 麗

（東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱 150040）

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）為一種分泌型的磷酸化糖蛋白，是成骨細(xì)胞的表型之一。最早由Franzen等研究骨基質(zhì)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，因其介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)的連接而得名。OPN在動物體中分布是有限的，如骨、腎、肌肉、膀胱及自然殺傷細(xì)胞等[1]，其中骨和腎臟中含量最多。OPN主要在骨組織形成的早期產(chǎn)生。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在骨基質(zhì)礦化開始后，成骨細(xì)胞中OPN mRNA水平開始升高[2]。因此，OPN被認(rèn)為是成骨細(xì)胞成熟分化的標(biāo)志，是骨形成和重塑過程中非常重要的細(xì)胞因子。

鹿茸為雄鹿（馴鹿除外）未骨化密生茸毛的幼角，在中醫(yī)臨床占有重要地位，鹿茸入藥距今已有兩千多年的歷史。鹿茸依靠其他動物器官無可比擬的生長速度、再生機(jī)理和神奇的藥用價(jià)值吸引了眾多科學(xué)家的高度關(guān)注[3-9]，現(xiàn)已成為研究哺乳動物細(xì)胞增殖、生長與分化的理想材料，可作為模擬人和動物軟骨內(nèi)成骨過程的最佳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀ＩL與骨化是鹿茸生長發(fā)育的兩個(gè)方面。有學(xué)者將鹿茸角從脫盤到生長停止劃分為生長期及骨化期。生長期內(nèi)，生長占優(yōu)勢，骨化緩慢。骨化期內(nèi)，鹿茸迅速骨化，沉積大量礦物質(zhì)，阻礙鹿茸的生長。鹿茸骨化程度越高，礦物質(zhì)含量就越高，有機(jī)成分比例下降。因此，鹿茸的骨化程度反映茸質(zhì)的老嫩和成分含量的變化，決定著茸的等級。如能抑制或減弱鹿茸骨化而又不影響鹿茸的生長，則可全面提升鹿茸的產(chǎn)量，使養(yǎng)鹿業(yè)的效益大大提高。闡明生長與骨化的關(guān)系是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的理論依據(jù)[10]。

目前GenBank中尚無鹿源OPN基因序列的任何記錄。本研究從梅花鹿鹿茸尖端組織的全長cDNA文庫中首次成功克隆了具有完整編碼區(qū)的OPN基因的全長cDNA序列，并對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，通過RT-PCR技術(shù)研究了鹿茸尖端不同組織層中OPN基因的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究OPN基因的功能及其在鹿茸骨化過程中的作用機(jī)制，指導(dǎo)鹿茸生產(chǎn)實(shí)踐奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取人工馴養(yǎng)的健康4歲成年東北梅花鹿公鹿為實(shí)驗(yàn)動物（該年齡段的公鹿鹿茸生長發(fā)育相對穩(wěn)定，以便縮小采樣誤差），在其生茸至二杠茸型時(shí)采集鹿茸頂端組織（該處為鹿茸生長發(fā)育中細(xì)胞增殖、生長和分化中心[11]）為試驗(yàn)樣品。取樣時(shí)，將鹿麻醉，用手術(shù)刀迅速切取鹿茸頂端約4 cm組織（見圖1），用酒精棉擦去茸皮表面污物，對照文獻(xiàn)[12]處理赤鹿生長頂端的分層方法（見圖2），切取皮膚層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織各25 mg，總共100 mg，于液氮保存。

圖1 取材位置Fig.1 Position of the sample in deer antler

圖2 組織分離位置Fig.2 Position of isolated tissue in deer antler

1.2 方法

1.2.1 OPN基因全長cDNA的獲得

按試劑盒SV Total RNA Isolation System（Promega公司）操作說明提取總RNA。依照CreatorTMSmaRTTMcDNA文庫構(gòu)建試劑盒（Clontech公司）的說明，進(jìn)行文庫構(gòu)建。在3730XL測序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）上使用 M13 通用引物對鹿茸尖端組織原始文庫中大量隨機(jī)挑取的單菌落進(jìn)行了5'端EST測序。利用Phrap軟件對高質(zhì)量的EST進(jìn)行聚類和拼接，對拼接后的一致序列采用BLASTX和BLASTN程序，在GenBank非冗余蛋白質(zhì)和核酸庫中進(jìn)行序列同源性比對及功能注釋。挑取OPN基因?qū)?yīng)的陽性菌落進(jìn)行PCR鑒定，搖菌制備質(zhì)粒，于測序儀上對陽性菌落質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙向測序。

1.2.2 OPN的生物信息學(xué)分析

采用ORF程序查找序列的開放閱讀框，利用ExPASy服務(wù)器上的軟件ProtParam和ProScal分別計(jì)算蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)及分析蛋白的疏水性，SignalP3.0預(yù)測蛋白的信號肽，TMpred預(yù)測此蛋白的跨膜區(qū)，應(yīng)用PSORTⅡ軟件進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位，BlastP軟體進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測，Motif Scan軟件進(jìn)行基序搜索，使用軟件DNAStar和GENEDOC進(jìn)行氨基酸的多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制。

1.2.3 OPN的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析

分別提取鹿茸尖端不同組織層的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)OPN基因的cDNA序列設(shè)計(jì)用于定量PCR的特異性引物（OPN-S:5'CATCT CAGAAGCAGACTTTC 3'；OPN-A:3'-TCGTCATC ATCATCTAGGTC 5'），以18S rRNA為內(nèi)參（18S-S:5'GGACTCTTAGCGGTGGATC 3'；18S-A:3'ATC GTCAAGCGACGCTCAG 5'），對鹿茸尖端不同組織層的OPN基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析。在MJ Research公司的DNA Engine OpticonTM2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-PCR，PCR反應(yīng)體系:第1鏈cDNA 3μL，SYBR PremixExTaqTM（2×）10μL，上、下游引物各1μL（10 pmol），去離子水5μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s，94℃12 s，57℃30 s，72℃30 s，45個(gè)循環(huán)，讀板溫度為81℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

聯(lián)機(jī)運(yùn)行軟件為MJ Opticon MonitorTMAnalysis Software Version 3.1。通過普遍使用的 2-△△Ct法[13-14]來計(jì)算分析基因在不同組織中的相對表達(dá)量:每個(gè)反應(yīng)做3次重復(fù)，取Ct值平均數(shù)；計(jì)算目標(biāo)基因的平均Ct值與內(nèi)標(biāo)基因18S rRNA平均Ct值的差（△Ct值）；通過每個(gè)測試樣品的△Ct值減去對照樣品的△Ct來確定△△Ct值。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPN基因全長cDNA的獲得

從梅花鹿茸尖端組織全長cDNA文庫中獲得的OPN基因的陽性菌落經(jīng)PCR鑒定，得到一條約1400bp的DNA插入片段（見圖3），進(jìn)一步制備質(zhì)粒進(jìn)行雙向測通，測序結(jié)果為1406bp，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)進(jìn)一步與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，證實(shí)為OPN基因的全長cDNA序列（見圖4）。

圖3 梅花鹿OPN基因cDNA菌落PCR結(jié)果Fig.3 Results of colony PCR of OPN gene cDNA from Sika Deer

2.2 OPN的序列分析

ORF程序顯示:OPN全長cDNA的5'非翻譯區(qū)為105bp，3'非翻譯區(qū)為461bp，開放讀碼框?yàn)?40bp，編碼279個(gè)氨基酸；利用NCBI的BlastP在蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫（Conserved domain database，CDD）對OPN基因進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測表明，與此基因匹配的蛋白保守區(qū)有1個(gè)Osteopontin結(jié)構(gòu)域，其匹配區(qū)段從第1個(gè)氨基酸到279個(gè)氨基酸（見圖5）；使用SignalP 3.0預(yù)測顯示該基因氨基端第1～16位氨基酸具有典型信號肽特征；ProtParam在線軟件預(yù)測OPN基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為30.99 ku，理論等電點(diǎn)為4.40，不穩(wěn)定系數(shù)54.42，屬于不穩(wěn)定蛋白。整個(gè)氨基酸組成中絲氨酸和谷氨酸殘基均占很高比例，這就賦予了OPN具有高的酸性特征；利用軟件TMpred進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測得知此蛋白為跨膜蛋白；ProtScale軟件對OPN氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析發(fā)現(xiàn)，在1～25區(qū)域的氨基酸具有較大峰值，且這個(gè)區(qū)域位于跨膜區(qū)，可見跨膜區(qū)的氨基酸多數(shù)是疏水性的，N端的強(qiáng)疏水信號可能與該蛋白的跨膜運(yùn)輸有關(guān)；使用PSORTⅡ軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白為胞外蛋白，推測前16個(gè)氨基酸殘基作為信號肽引導(dǎo)OPN編碼蛋白定位于細(xì)胞外，在胞外發(fā)揮作用。

2.3 不同物種間OPN的同源性分析

將梅花鹿與GenBank中選取的9種動物的OPN氨基酸全序列進(jìn)行BlastP，發(fā)現(xiàn)與歐洲牛、山羊的OPN具有很高相似性，分別為86%和85%；與野豬、人、馬、金倉鼠及家犬的相似性較高，分別為65%、59%、57%、53%和50%；而與鵪鶉、原雞的OPN序列之間的變異程度較大，相似性較低，分別為32%和31%。

圖4 OPN基因的全長cDNA序列和推定的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OPN cDNA

圖5 推導(dǎo)的OPN氨基酸保守區(qū)查找Fig.5 Search for the conserved domains in deduced sequence of amino acid of OPN

應(yīng)用軟件DNAStar和GENEDOC對9個(gè)物種的OPN氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖6、7）。結(jié)果表明，不同種屬的OPN氨基酸表現(xiàn)出較高的同源性，說明OPN基因作為功能基因在進(jìn)化中比較保守。樹圖顯示，在該基因座位上梅花鹿與山羊和歐洲牛在進(jìn)化關(guān)系上較近，而與鳥類（如鵪鶉、原雞）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 OPN基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析

RT－PCR結(jié)果顯示，OPN的表達(dá)量從鹿茸皮膚層到前軟骨層逐漸上升，到軟骨層表達(dá)量又下調(diào)，且前軟骨層和軟骨層的表達(dá)量均高于間充質(zhì)和皮膚層（見圖 8）。

圖6 梅花鹿與其他動物OPN氨基酸的多重序列比對Fig.6 Multiple alignment of amino acid sequences of the Sika Deer and other animal OPN

圖7 動物OPN系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of animal OPN

圖8 鹿茸尖端不同組織層中OPN基因的表達(dá)差異Fig.8 Expression of OPN genes in different tissues of velvet tip

3 討論與結(jié)論

結(jié)合Motif Scan軟件對功能位點(diǎn)的查找及不同物種間的多重序列比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OPN氨基酸在26-29[SSEE]位酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、110-126位的富含天門冬氨酸的編碼區(qū)及151-156位含RGD細(xì)胞黏附序列區(qū)域呈高度保守（見圖6）。羧基端RGD（Arg-Glu-Asp）序列是OPN能夠結(jié)合大量Ca2+以及與羥磷灰石具有高吸附作用的原因[15-16]。現(xiàn)已確定該序列通過與整合素家族中受體的識別，從而介導(dǎo)了細(xì)胞粘附和細(xì)胞遷移。OPN的系統(tǒng)進(jìn)化樹分為兩大支，1支為哺乳動物，另1支為鳥類，其分析結(jié)果與物種的傳統(tǒng)分類學(xué)地位十分一致，且符合進(jìn)化關(guān)系。

在梅花鹿鹿茸尖端組織的ESTs中OPN基因?qū)儆诟哓S度表達(dá)基因，Apparao等[17]研究認(rèn)為OPN基因的表達(dá)具有波動性。本研究也發(fā)現(xiàn)，在鹿茸尖端不同組織層中OPN表達(dá)水平的波動性變化。OPN有促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼附于細(xì)胞外基質(zhì)上的功能[18-19]，產(chǎn)生該作用的機(jī)制是它的分子內(nèi)部含有一特殊結(jié)構(gòu)RGD序列，該序列是促進(jìn)細(xì)胞黏附的蛋白質(zhì)中的特有結(jié)構(gòu)。另外，OPN作為由單核細(xì)胞衍生的破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)器，能夠指導(dǎo)最初的破骨細(xì)胞識別并黏附到骨上，通過與αvβ3整合素相互作用刺激破骨細(xì)胞遷移，從而提高了骨的吸收[20]。組織鈣化的一個(gè)重要事件就是蛋白的降解，由此，我們推測OPN可能通過介導(dǎo)破骨細(xì)胞與礦化組織的黏附，從而參與了鹿茸組織的礦化。

OPN是在骨代謝過程中起重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，本研究首次從梅花鹿鹿茸尖端組織cDNA文庫中成功克隆了具有完整編碼區(qū)的OPN基因的全長cDNA序列，并且由EST分析得知OPN基因在所構(gòu)建的鹿茸尖端組織cDNA文庫中為高豐度表達(dá)基因，提示它可能是鹿茸發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子。研究鹿茸骨化機(jī)制不僅可以揭示茸質(zhì)的老嫩和成分含量的變化，直接決定鹿茸最佳采摘時(shí)間、等級，同時(shí)對建立以鹿茸為骨發(fā)育模型具有重大意義。鹿茸的骨化機(jī)理非常復(fù)雜，深入研究其各種調(diào)控機(jī)制，不僅可以提高鹿茸的產(chǎn)量和質(zhì)量，還有助于骨病的治療，而且也為新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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