烏連止瀉顆粒劑中揮發油提取和包合工藝研究

李繼昌，于文會，張秀英，侯振中，徐 利，姜曉文，徐倩倩

（1.東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市和平獸藥有限公司，哈爾濱 150039）

犢牛腹瀉可由細菌、原蟲、病毒或以上因素混合感染引起，是引發奶牛和肉牛死亡的主要原因，能造成巨大的經濟損失[1-2]。本病一年四季均可發生，尤其以初春及夏末秋初多發，特征是拉稀、嘔吐、脫水和體重減輕。如臨床診治不當，不僅幼畜的生長發育受阻，而且極易死亡。近年來發病率和死亡率不斷增高。目前該病治療主要以抗生素為主，但因其毒副作用而易致幼畜臟器損害，使病情加重。長時間應用抗生素還會導致耐藥性的產生。中獸醫學認為，犢牛為稚陽，稚陽之體氣血未充，臟腑嬌嫩，脾胃素弱，因而脾常不足。如飼養管理不當，寒熱不調以及風寒暑濕所侵，致使脾胃功能失調而發生腹瀉[3]。中獸藥是應用中獸醫學扶正祛邪的治療原則和現代醫學整合調整理論，重在調節機體自身免疫力，兼有抑菌、消炎、止痛等效用，標本兼治，尤其在減輕細菌耐藥性和抗生素副作用等方面具有西藥無法比擬的優勢。烏連止瀉顆粒劑由烏梅、黃連、白術、木香、干姜、甘草組成，是用于治療犢牛腹瀉病的純中藥制劑。其中黃連清熱、燥濕、解毒、瀉火[4]；烏梅斂肺澀腸、生津止渴、驅蟲止痢，白術健脾益氣、燥濕利水；干姜溫中散寒、回陽通脈、燥濕消痰；木香行氣止痛、健脾消食；甘草補益中氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、緩和藥性[5]。六藥合用，共奏扶正祛邪、清熱解毒、殺菌抗菌、理氣健脾之功效[6-7]。本文對烏連止瀉顆粒劑中干姜、白術、木香、甘草含有的揮發油成分提取和包合工藝進行了研究，旨在為提高揮發油的有效溶出和增加其穩定性提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

干姜、白術、木香、甘草均購于黑龍江省藥材公司。

1.2 揮發油提取條件的優選

1.2.1 加水量考察

分別稱取白術、干姜、木香、甘草各60 g，混勻，均分為3份，分別加入6、8、10倍量的水，共水回流冷凝法提取揮發油6 h，記錄揮發油得量。

1.2.2 浸泡時間考察

分別稱取白術、干姜、木香、干草各60 g，混勻，均分為3份，加8倍量水后分別浸泡0、4、8 h，共水回流冷凝法提取揮發油6 h，記錄揮發油得量。

1.2.3 提取時間考察

分別稱取白術、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，共水回流冷凝法提取揮發油，并記錄每小時出油量。

1.2.4 藥材粉碎度考察

分別稱取白術、干姜、木香、甘草各40 g，混勻，均分為2份（分別為未粉碎飲片和粗粉），加8倍量水，共水回流冷凝法提取揮發油，并記錄每小時出油量。

1.2.5 揮發油提取率考察

取白術、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，按上述篩選最佳條件共水回流冷凝法提取揮發油6 h，共3批，計算揮發油的出油率。

1.3 包合工藝研究

1.3.1 β-CD包合揮發油的正交試驗

根據預試驗結果和文獻資料報道，選擇β-CD（β-環糊精）∶揮發油、β-CD∶水、包合溫度和包合時間為考察因素，用L9（34）進行正交試驗，并以包合物收得率和揮發油利用率作為考察指標以篩選優化水平條件，揮發油包合工藝因素水平見表1。

表1 揮發油包合工藝因素水平表L9（34）Table 1 Experimental factors and levels L9(34)of volatile oil clathration technology

1.3.2 包合物制備

按表1進行正交試驗，精密稱取β-CD適量，置于250mL具塞三角瓶中，加入適量蒸餾水，沸水浴中加熱使溶解，降至規定溫度，于磁力攪拌器上恒溫攪拌30 min，精密量取揮發油適當體積，按1∶10用無水乙醇稀釋，將其注入含β-CD溶液中，加塞，恒溫攪拌至規定時間。置4℃冷藏12 h，抽濾，用石油醚25mL洗滌3次，真空干燥24 h即得粉末。

1.3.3 包合物中揮發油及空白回收率的測定

將制得的包合物置250mL圓底燒瓶，加入蒸餾水100mL，參考文獻[8]測定包合物中實際含油量和揮發油空白回收率。

1.3.4 包合物質量檢查

采用電子顯微鏡觀察包合物的性狀。應用薄層色譜法檢查包合物的質量:①供試液1的制備:稱取包合物適量，提取揮發油，取揮發油0.5mL，加無水乙醇0.5mL，作供試液1；② 供試液2的制備:稱取包合物1 g，用無水乙醇2mL溶解，振搖過濾，濾液作為供試液2；③陽性對照溶液的制備:取包合前白術、干姜、木香、甘草混合提取揮發油0.5mL，加無水乙醇0.5mL，做供試液3。④TLC鑒別:取供試液1、2、3對照溶液各2μL，共3份分別點樣于同一硅膠GF 254板上，分別用展開劑 1，環己烷∶苯∶乙酸乙酯（70∶15∶15）；展開劑 2，石油醚∶乙酸乙酯∶苯（70∶15∶15），上行展開18 cm，取出，晾干，再分別噴1%對二甲氨基苯甲醛-硫酸溶液，5%香草醛-硫酸溶液，100℃烘干至顯色清晰。

1.3.5 包合工藝驗證試驗

精密量取揮發油2mL，3份，分別置250mL圓底燒瓶中，按最佳工藝條件包合，測定包合物收得率和揮發油利用率。

2 結果與分析

2.1 揮發油提取條件優選結果

2.1.1 加水量考察結果

由表2可知，藥材加水量為6倍投藥量時的揮發油提取量較加水8、10倍時低，且易糊化，故不選擇。加水量為8、10倍投藥量時，揮發油提取量基本無差異。考慮生產實際，故揮發油的加水量定為8倍投藥量。

表2 加水量對揮發油提取量的影響Table2 Effects of imbination amount to volatile oil extraction ratio

2.1.2 浸泡時間考察結果

由表3可知，藥材浸泡與否對提取揮發油量基本沒有影響，故藥材不用提前浸泡。

2.1.3 提取時間考察結果

表4顯示，提取6 h時揮發油提取率已達98.4%，故將提取時間定為6 h。

表3 浸泡時間對揮發油提取量的影響Table3 Effects of soak time to volatile oil extraction ratio

表4 提取時間對揮發油提取量的影響Table4 Effects of extracting time to volatile oil extraction ratio

2.1.4 藥材粉碎度考察結果

由表5可知，揮發油提取最佳工藝為藥材粉碎成粗粉，加8倍量水，不浸泡，提取6 h。

2.1.5 揮發油提取量考察結果

取白術、干姜、木香、甘草各20 g，加8倍量水，按上述篩選最佳條件共水回流冷凝法提取揮發油6 h，計算揮發油的提取量平均為0.61mL。

2.2 包合工藝試驗結果

2.2.1 空白回收率測定結果

經測，揮發油空白回收率為90%。

表5 粉碎與否對揮發油提取量的影響Table5 Effects of crush degree to volatile oil extraction ratio

2.2.2 包合物中揮發油測定結果

揮發油在不同條件下包合正交試驗結果見表6。經統計分析可知，對于包合物收得率的影響大小的因素依次為 A＞C＞D＞B，且 A2＞A3＞A1，B1＞B3＞B2，C2＞C1＞C3，D1＞D2＞D3，其中僅 A 因素對包合物收得率有顯著差異（P＜0.05）。四因素對揮發油利用率的影響大小依次為 A＞C＞D＞B，且 A2＞A3＞A1，B2＞B1＞B3，C2＞C3＞C1，D2＞D1＞D3。其中 A 因素有極顯著影響，C因素有顯著影響，故選定A因素的水平為A2；B因素對包合物收得率和揮發油利用率均無顯著影響，所以選擇經濟實惠的B1；C因素確定為C2；D因素對揮發油利用率和包合物收得率均無顯著影響，所以選擇較為經濟的D1。所以揮發油包合的最佳工藝為 A2B1C2D1，即 β-CD∶ 揮發油為 4∶ 1，β-CD∶水為1∶8，包合溫度40℃，包合時間為30 min。

2.3 包合物檢查結果

2.3.1 電子顯微鏡檢查結果

按照驗證工藝，不加揮發油制備空白β-CD，為無色半透明片狀規則晶體。添加揮發油的包合物為含有淡黃色不規則團塊狀物質。

2.3.2 薄層層析檢查包合物包合效果

陽性對照液和供試液均能清楚見到主斑點，而陰性對照液無斑點，說明揮發油被包合并且其主要成分未發生變化。

2.3.3 包合工藝驗證結果

按最佳包合工藝驗證3批，其包合物收得率、揮發油利用率穩定，說明該工藝較穩定，結果見表7。

表6 揮發油包合工藝正交試驗Table6 Form of orthogonal experiment of volatile oil clathration

3 討論與結論

3.1 揮發油提取主要影響因素

烏連止瀉顆粒劑中白術、干姜、木香含有效成分揮發油，在生產中單獨提取每味藥是不經濟的。李孝棟等報道[9]，白術、干姜同時提取，對二者揮發油的溶出有促進作用。在預試驗中采用直接測定揮發油提取量確定對提取量的影響；薄層色譜法檢測藥物主要成分主斑點確定對揮發油性質的影響，發現三種藥物同時提取并不影響溶出率。甘草本身并不含有揮發油，本試驗選用甘草與以上三味藥同時提取揮發油，發現甘草并不影響揮發油的溶出，反而對揮發油有一定的穩定作用，所以試驗選擇甘草與白術、干姜、木香同時提取揮發油，起到調和諸藥作用。另外，藥材粉碎與否對揮發油的提取影響較大。直接用中藥飲片提取揮發油僅有少量揮發油，無法收集，而粉碎后提取量顯著增加。但粉碎過細藥粉容易糊化，不利于揮發油溶出，也會損壞揮發油提取器。故試驗采用粗粉進行提取。

3.2 包合工藝影響因素

有文獻報道，制備顆粒劑時可將揮發油噴灑于顆粒劑表面，浸透一段時間，以使揮發油透入顆粒劑內部，但揮發油本身有易揮發特性，且在常溫條件下易被氧化變性，從而影響藥效。β-CD安全、低毒，在胃內不被分解破壞，腸道內分解為低聚糖，對于制備顆粒劑是良好的選擇。β-CD包合還能夠穩定揮發油性質，故本試驗選用β-CD包合工藝。

影響包合的因素很多，如稀釋揮發油的有機溶劑、β-CD與水的比例、環糊精與油的比例、包合的方法等。預試驗中，曾采用研磨法、超聲法、攪拌法進行揮發油的包合。研磨法中β-CD直接與2～5倍量水研勻，β-CD在顯微鏡下觀察為不規則團塊狀物質，并未發現形成晶體，其包合率很低，且包合物質地堅硬，不適宜作顆粒，故不采用此法。超聲法與攪拌法均能形成晶體，包合率和包合物質地也無大差異，但超聲法所得包合物，薄層層析鑒別包合物揮發油時發現，其主斑點不清晰，可能是超聲對藥物的化學結構有一定破壞作用，所以本試驗選用攪拌法包合。

[1]Janke B H.Symposium on neonatal calf diarrhoea[J].Veterinary Medicine,1989,84:803-810.

[2]Paul P S,Lyoo Y S.Immunogens of rotaviruses[J].Veterinary Microbiology,1993,37(3-4):299-317.

[3]周志平.中藥止瀉散治療新生犢牛腹瀉[J].畜牧與獸醫,2001,33(6):44-45.

[4]孟倩,李繼昌,柳穎,等.抗仔豬腹瀉中藥口服液的質量標準研究[J].東北農業大學學報,2008,39(5):90-93.

[5]梁冰,楊愛馥,黃鳳蘭,等.甘草屬（Glycyrrhiza）化學成分及藥理作用研究進展[J].東北農業大學學報,2006,37(1):115-119.

[6]徐倩倩,李繼昌,李永科,等.中草藥對犢牛腹瀉主要病原菌體外抑菌試驗[J].中國奶牛,2008,7:31-33.

[7]徐倩倩.犢牛腹瀉中藥顆粒劑組方篩選及制備[D].哈爾濱:東北農業大學,2008.

[8]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版二部[M].北京:中國農業出版社,2005:附錄47.

[9]李孝棟,潘衛三,吳立軍,等.干姜和白術揮發油提取工藝[J].沈陽藥科大學學報,2003,20(1):45-47.