禽流感血凝抑制試驗中鴨血清非特異性凝集因子去除方法研究*

鄧 波,李凱航,薛 霞,孫泉云*

(1.上海市動物疫病預防控制中心,上海201103;2.上海交通大學,上海200240)

近年來,由于禽流感病毒的變異,水禽在病毒傳播過程中所扮演的角色已經發生改變,由不易感但能帶毒的貯存宿主演變為易感動物,所以鴨禽流感的監測工作具有更加重要的意義[1-5]。然而,在鴨禽流感血清抗體的監測工作中,常遇到鴨血清對雞紅細胞懸液的非特異凝集現象,造成在血凝抑制試驗結果判定時,雞紅細胞不流淌或流淌不完全,給結果判定造成嚴重干擾[6-10]。

為尋求能有效去除鴨血凝抑制試驗(HI試驗)中非特異現象,且便于應用的測定方法,我們選取了能夠去除水禽血清中非特異性抑制因子的50 mL/L雞紅細胞吸附預處理法和同源鴨紅細胞直接測定法,以比較其檢測效價和判定效果。

1 材料與方法

1.1 材料

禽流感H5亞型HI抗原,重組H5亞型禽流感油乳劑滅活苗,由哈爾濱獸醫研究所生產。

1.2 方法

1.2.1 紅細胞懸液 10 mL/L、50 mL/L雞紅細胞懸液,10 mL/L鴨紅細胞懸液按GB/T 18936—2003方法進行制備。

1.2.2 免疫程序 11日齡時進行免疫,分組情況如下:A、B組免疫接種0.5 mL,C組免疫接種0.8 mL,D組免疫接種1 mL,E組為非免疫對照組;39日齡時B組1 mL劑量二免;A,B,C,D組每組30羽,E組40羽,每次隨即抽取20羽。

1.2.3 血清準備 選定奉賢某鴨場為實驗場,購買實驗鴨160羽,按照免疫方案每隔5 d采集白羽肉鴨血清,共采集900份樣品。進行初步體液抗體檢測后,選定具代表性的血清60份進行重復試驗。

1.2.4 紅細胞配制 按如下4種方法進行鴨血清禽流感H5亞型抗體效價檢測。A組10 mL/L雞紅細胞直接測定法;B組10 mL/L鴨紅細胞直接測定法;C組50 mL/L雞紅細胞吸附+雞紅細胞測定;D組50 mL/L雞紅細胞吸附+鴨紅細胞測定。

吸附方法是在每0.5 mL的樣品血清中加入0.025 mL的雞紅細胞,輕搖后靜置至少30 min;800 r/min離心2 min～5 min,收集上清,即為處理后的血清。

2 結果

分別用雞紅細胞懸液、鴨紅細胞懸液對60份鴨血清進行HI試驗。

4種測定方法非特異性凝集現象去除效果對比見表1;4種測定方法之間使用SPSS統計軟件進行獨立樣本T檢驗結果見表2;4種測定方法血清效價具體結果見表3(效價單位為Log2)。

表1中,2列凝集數/凝集率分別是指“第1孔～2孔出現凝集現象的凝集數/凝集率”與“2孔以后出現凝集現象的凝集數/凝集率”,采用4種方法總凝集率分別為:48.3%、15.0%、13.3%、8.3%。其中,第1～2孔出現凝集現象的凝集率分別為36.7%、6.7%、11.6%、5.0%;2孔以后出現凝集現象的凝集數/凝集率分別為11.7%、8.3%、1.7%、3.3%。

表2中,B、C、D 3種方法分別和A法進行了比較,結果表明,B、C、D法測得的效價與A法差異不顯著(P＞0.05)。

表3為60份血清分別用4種方法檢測后的結果匯總。

表1 4種測定方法非特異性凝集現象去除效果對比Table 1 Results of 4 methods to remove the nonspecific agglutination reaction

表2 四種方法t檢驗Table 2 Results of 4 methods for t-test

表3 四種測定方法血清效價結果T able 3 Results of 4 methods to determine the antibody titre

3 討論

從表1結果來看,血清經50 mL/L雞紅細胞吸附處理后,非特異性凝集率由A法的48.3%下降至C法的13.3%,而D法的非特異性凝集率則可以下降到8.3%,表明D法在去除非特異性凝集因子方面較理想。A法的非特異性凝集主要出現在前兩孔,達到總非特異性凝集量的75.9%,說明非特異性凝集以前兩孔為主。B法相對于A法在降低前兩孔的非特異性凝集率上效果明顯,C法相對于A法在降低兩孔以后的非特異性凝集上效果明顯,D法在去除非特異性凝集上整體效果最好。在消除非特異性因子方面,采用D法能夠獲得理想結果。

B法檢測血清無須前處理,具有操作簡便、耗時短的優點,與國標方法相比較,血清效價差異介于1 log2～3 log2之間,非特異性凝集率有所降低。統計分析顯示,B、C、D法測得的效價與A法差異不顯著,說明這3種方法和國標法符合率高,對真實效價不會產生偏差。但在小樣本量檢測時,為了降低因非特異性造成的偏差,可以選擇B法或者D法。

在日常檢測中可以使用B法進行大樣本量的檢測。在進行課題研究等小樣本、高精度要求的檢測時,適宜使用D法以更有效去除非特異性反應。

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