半定量RT-PCR檢測豬延髓中色氨酸羥化酶2基因表達方法的建立*

馬紅娜,鄧銜柏*,馬勇江,何 敏,習欠云,寧章勇,張桂紅,盧培成,張曼玉

(1.華南農業大學獸醫學院,廣東廣州510642;2.廣東科貿職業學院,廣東廣州510430;3.華南農業大學動物科學學院,廣東廣州510642)

色氨酸羥化酶2(tryptophan hydroxylase 2,TPH-2)是色氨酸羥化酶的亞型之一,該基因優先在腦干中表達,負責合成中樞5-羥色胺(5-hydroxytryp tamine,5-HT),代表神經性TPH基因[1]。TPH-2為中樞5-H T合成的限速酶,具有專一性,在組織中含量較低,且具有不穩定性。TPH-2基因單核苷酸多態性與精神疾病有某種程度的聯系,目前國內外有TPH-2基因單核苷酸多態性與抑郁癥及自殺行為研究的報道[2-5],對色氨酸羥化酶的研究已經成為熱點。

應激是動物在生存過程中受到各種各樣刺激后產生的非特異性適應性反應。適度應激可使機體度過短期惡劣環境,適應能力得到提高,但強烈應激可影響多種生理活動和行為,長期應激會使機體神經內分泌失調,免疫力下降,引起胃腸道疾病,甚至不良精神變化。當體內受到心理、生理等刺激時可伴有腦內5-HT合成及代謝的改變。在一般研究TPH的試驗中,都會有驅趕動物的可能。在豬的飼養管理過程中,常發生驅趕應激的現象。這種驅趕應激是否對延髓中的TPH-2有影響,所以本試驗選擇比運動性疲勞溫和的驅趕應激來研究中樞TPH-2的變化。

對于TPH-2的定性和定量,較常用的是免疫印跡、免疫細胞化學和免疫沉淀方法[6]。但這些方法難以及時、快速地檢測到機體內TPH-2的表達。鑒于此本試驗擬采用RT-PCR技術對TPH-2進行半定量檢測,建立半定量檢測TPH-2的表達方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 試驗所用的仔豬延髓組織采自廣州市增城區某豬場。分別選出相同日齡,體重相似的仔豬20頭,隨機分為兩組,一組為驅趕應激組,一組為直接處死組,驅趕組驅趕應激后立刻處死5頭,直接處死組直接處死5頭。

1.1.2 試劑和儀器 Trizol(Invitrogen),EXTaqDNA聚合酶寶生物工程(大連)有限公司,TaqDNA聚合酶寶生物工程(大連)有限公司,DL2000 Maker(TAKARA),反轉錄試劑盒(MBI),DEPC,溴化乙錠,瓊脂糖等試劑。低溫離心機,超凈工作臺,核酸分析儀,PCR儀,凝膠成像儀,電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 延髓組織RNA的提取

1.2.1.1 裂解 取約0.1 g延髓組織放入研缽內,在液氮中將組織充分研磨成粉狀后,倒入1.5 mL EP管中,加入1 mL T rizol溶液,充分振蕩混勻。室溫孵育10 min,4℃12 000 r/min離心5 min,棄沉淀。

1.2.1.2 分離 按1 mL T rizol加入200 μ L氯仿的比例加入RNA專用氯仿,劇烈振蕩15 s,冰上靜置2 min,4℃12 000 r/min離心15 min。

1.2.1.3 沉淀 取上清層到一個新1.5 mL EP管中,加入500 μ L RNA專用異丙醇,顛倒混勻,4℃孵育10 min,4℃12 000 r/min離心10 min。

1.2.1.4 洗滌 棄上清,向管中加入1 mL冰浴的750 mL/L乙醇洗滌沉淀,4℃7 500 r/min離心7 min,棄去上清。

1.2.1.5 溶解 RNA適度干燥后,用30 μ L無RNA酶水溶解。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量,核酸分析儀測量其濃度,以便在反轉錄的過程中進行定量。若暫時不用,可保存在—70℃中。

1.2.2 反轉錄 用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA,cDNA可直接用于PCR擴增。

1.2.3 RT-PCR擴增反應

1.2.3.1 引物序列 應用Primer Premier5.0軟件,按照引物設計的基本要求,設計β-actin和TPH-2基因擴增引物。β-actin和TPH-2基因擴增長度分別為102 bp和398 bp。所有引物均由英俊公司合成,使用前將引物稀釋至10 mmol/L。

1.2.3.2 退火溫度 β-actin和TPH-2基因在其引物Tm±5℃的范圍內設溫度梯度。兩對引物的Tm不同,需分別擴增,篩選出各自最佳的退火溫度。

1.2.3.3 Mg2+濃度篩選 在標準PCR反應條件下,選擇不同Mg2+濃度(分別為1.25、1.50、2、2.5、2.75 mmol/L)擴增。擴增產物瓊脂糖凝膠電泳,根據產量和特異性,確定最適合的Mg2+濃度。

1.2.3.4 循環數確定 選擇適當的循環數,使擴增產物處在平臺期前的線性增長范圍內,并在瓊脂糖凝膠上清晰可見和定量。所檢測的目的RNA和內標β-actin最佳循環次數須在同一范圍?；騎PH-2和β-actin的PCR反應體系為:2.5 μ L cDNA產物,0.5 μ L Taq酶,TPH-2基因(或β-actin基因)上下游引物各2 μ L,dNTP 4 μ L,5 μ L 10×buffer,MgCl2(25 mmol/L)待定,終體積50 μ L。反應程序如下:94℃5 min;94℃30 s,退火溫度待定,30 s,72℃30 s(23、25、27、30、35個循環);72℃7 min,4℃保存。

1.2.4 凝膠電泳、凝膠成像和定量分析 PCR擴增產物50 μ L與6×Loading buffer混勻,吸取6 μ L到20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,點上DL 2 000 Marker,以確定擴增產物片段的大小。80 V電泳15 min,溴化乙錠(EB)染色,凝膠成像系統拍照,并用Gelpro凝膠分析軟件分析。結果用TPH-2基因和β-actin電泳帶IOD的比值表示。

1.2.5 數據分析 用SPSS10.0版統計軟件處理,數據以均數±標準差表示,采用配對t檢驗和X2檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 延髓組織總RNA的提取

采用Trizol法提取全部延髓組織總RNA。各取3 μ L,經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量,延髓組織總RNA的28 S rRNA、18 S rRNA條帶清晰明亮,無拖帶現象,且28 S rRNA的亮度是18 S rRNA的二倍,表明提取的RNA樣品較為完整,基本無降解。用核酸分析儀測定RNA的濃度,其OD260/OD280比值均在1.8～2.0,說明樣品的純度較高,定量后可用于后續的試驗(圖1)。

圖1 總RNA提取結果Fig.1 The ex traction result of total RNA

2.2 退火溫度的確定

在進行退火溫度梯度試驗時,將β-actin引物的溫度設置在38℃～52℃,β-actin目的片段長度為102 bp,TPH-2引物的溫度在40℃～50℃,目的片段為398 bp。經過對PCR產物電泳結果的分析得出,TPH-2基因片段擴增的最佳退火溫度為45℃;內參β-actin基因片段擴增的最佳退火溫度為45℃(圖2)。

2.3 Mg2+濃度對擴增效率的影響

Mg2+是影響Taq酶擴增效率的重要因素,一般在1.25 mmol/L～2.75 mmol/L,但擴增效率因序列不同而有不同。應用分析軟件對電泳條帶IOD值進行分析時發現,在2 mmol/L時擴增效率及特異性良好;Mg2+濃度在1.5 mmol/L～2.5 mmol/L時對β-actin基因特異性引物的擴增效率影響不是很明顯。故試驗選用2 mmol/L Mg2+濃度進行TPH-2基因和β-actin基因的擴增(圖3和圖4)。

圖2 TPH-2和β-actin退火溫度的確定Fig.2 Determination of Tm of TPH-2 and β-actin

圖3 不同Mg2+濃度下TPH-2 PCR產物電泳結果Fig.3 Electrophoretic result of TPH-2 PCR product at different Mg2+concentration

圖4 不同M g2+濃度下β-actin產物電泳結果Fig.4 Electrophoretic result of β-actin PCR product at different Mg2+concentration

2.4 PCR循環數的確定

為使半定量結果更加準確,試驗分別用5個不同循環數(23、25、27、30、35個循環)對目的基因進行擴增,分析擴增產物的20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果,以條帶亮度作為選擇循環數的根據。從圖5可見TPH-2基因中30個和35個循環所得條帶亮度已基本一致,表明擴增進入平臺期,TPH-2基因在25個循環時擴增的不同樣本cDNA,條帶明暗度有差異,可見此時處于線性增長期(圖6)。β-actin在27個循環時進入平臺期,兩個擴增循環數需保持一致,因此確定25個循環為擴增循環數(圖7)。

2.5 RT-PCR結果

β-actin基因RT-PCR擴增后20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果顯示各條帶亮度基本一致(圖8)。圖9為TPH-2基因RT-PCR擴增后20 g/L瓊脂糖凝膠電泳結果,可見條帶亮度有差異,可用來作為刺激對TPH-2基因表達的半定量檢驗。

圖5 TPH-2擴增循環數確定Fig.5 Determination of amplification cycles of TPH-2

圖6 TPH-2在25個循環時的擴增 Fig.6 Amplification result of TPH-2 gene

圖7 β-actin擴增循環數確定Fig.7 Determination of amplification cycles of β-actin

圖8 β-actin 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8 Electrophorog ram of β-actin 20 g/L agarose

圖9 TPH-2 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.9 Electrophorogram of TPH-2 20 g/L agarose

2.6 試驗數據統計

利用Gelpro凝膠成像系統軟件分析得出β-actin、T PH-2基因PCR產物的灰度值,TPH-2的灰度值分別除以β-actin的灰度值,得出相對灰度值(表1)。

表1 TPH-2 mRNA在延髓組織及其驅趕應激組織中表達量的差異Table 1 The diferences gene ex pressions of TPH-2 between none hustle stress and hustle stress

2.7 TPH-2及β-actin基因相對表達量與驅趕應激的關系

半定量得出的相對灰度值,經統計分析其結果為P＞0.05,TPH-2基因在兩組延髓組織中表達差異不顯著,灰度分析表明,TPH-2 mRNA在直接處死延髓組織及其配對驅趕應激延髓組織中表達量有差異,TPH-2 mRNA在驅趕應激的延髓組織中表達上調。表明驅趕應激對TPH-2基因mRNA表達量的有影響但影響不顯著。

3 討論

3.1 關于TPH

TPH為5-H T合成的關鍵酶和限速酶,直接決定著神經元內5-HT的含量。5-HT又稱血清素(serotonin),它既是重要的單胺類神經遞質,又是一種血管活性物質,在中樞神經系統中分布廣泛,幾乎參與生物體所有的生理活動和行為功能的調控,包括情感、認知、感覺,以及內分泌功能、胃腸道功能等。TPH的生理活性和表達水平的正常與否影響著5-H T的合成量,可以增強或減弱5-HT及其代謝物的作用強度,進而影響它在中樞神經系統的功能。TPH分為TPH-1及TPH-2,其中T PH-2對中樞5-HT的合成具有重要作用[7]。因而TPH-2基因也成為與5-HT功能紊亂相關的精神疾病遺傳學研究中的一個重要的候選基因,并日益受到關注及重視。

色氨酸羥化酶是5-H T合成的關鍵酶和限速酶,其活性和其合成速度直接決定著神經元內5-H T的含量。在此次試驗中,色氨酸羥化酶轉錄有上調趨勢,5-HT有可能會增加,當增加達一定程度時就會引起機體不適。中樞神經系統5-HT含量及功能異?？赡軐е聡I吐、引起精神病和偏頭痛等多種疾病。但5-HT、色氨酸羥化酶、嘔吐現象之間的聯系的報道很少,需進一步研究證明。

3.2 有關TPH-2的RT-PCR檢測

在酶的表達分析中,常用的有實時熒光定量PCR、Northern blot、免疫印跡、免疫細胞化學、免疫沉淀等定量技術,但這些方法費時費力,費用較高,且需要特殊儀器。半定量逆轉錄多聚酶鏈反應因其費用低、技術操作相對簡便、快速,近年來被廣泛地應用于RNA表達研究中[8-11]。這種方法將mRNA反轉錄成cDNA,然后進行PCR擴增,通過測定PCR產物的量,可以推出各樣品中特異mRNA的相對含量。

雖然RT-PCR檢測快速簡單,但受很多因素影響[12]:①總RNA和cDNA的質量,在用RT-PCR法來對mRNA進行半定量時,只有在總RNA未被降解的情況下,才能保證其中mRNA的完整性和反轉錄的cDNA的質量,從而能夠真實的反映起始模板中基因表達量的差異。為達到這一要求,從采集樣本到反轉錄都要保證無RNA酶污染,盡量減少RNA的降解。檢測總RNA的完整性是必要的,濃度不高,完整性差的樣本盡量棄用,以免影響試驗結果。有時為避免樣品中DNA殘留造成的假陽性的影響,在反轉錄時,需用DNA酶消除殘存在樣品中的DNA。②引物的選擇,引物的好壞往往是PCR反應成敗的關鍵,做半定量檢測時,引物特異性要高,否則會影響反應結果。③PCR循環數的確定,PCR擴增反應是酶促反應,遵循酶促反應定律。產物與模板有一個線性關系,RT-PCR技術就是利用這一點來對目的基因中mRNA表達進行定量。表達豐度不同的基因半定量分析的PCR循環數不同。選擇合適的循環數不僅能使擴增產物在瓊脂糖凝膠上清晰可見和定量,也可使擴增反應在到達平臺期前的線性范圍內進行,這樣半定量的結果就更加準確。

總之,半定量RT-PCR是一種粗略地估計基因表達的相對變化的方法,若要精確地計算基因的表達量還需利用實時熒光PCR等技術方法。由于多數研究并不是檢測轉錄水平微小的變化或確切的表達量,而是檢測其表達水平變化差異是否顯著。所以,隨著該技術的日趨成熟與完善,半定量分析mRNA水平的方法將成為研究者的強有力的研究手段。在本試驗中,TPH-2 mRNA在驅趕組和直接處死組的兩組延髓組織中表達差異不顯著,在驅趕應激的延髓組織中表達上調。表明驅趕應激對TPH-2基因mRNA表達量有影響但影響不顯著,為下一步對色氨酸羥化酶的研究提供依據和技術支持。

[1] Walther D J,Peter J U,Bashammakh H S,et al.Synthesis of serotonin by a second try ptophan hydroxylase isoform[J].Science,2003,299:76.

[2] Zill P,Preuss U W,Koller G,et al.SNP-and haplotype analysis of the tryptophan hydroxy lase 2 gene in alcohol-dependent patients and alcohol-related suicide[J].Neuropsychopharmacology,2007,32:1687-1694.

[3] Lopez Delara C,Brezo J,Rouleau G,et al.Effect of tryptophan hydroxylase-2 gene variants on suicide risk in major depression[J].Biol Psychiatry,2007,62:72-80.

[4] 張玉琦,袁國楨,李桂林,等.TPH2基因rs7305115單核苷酸多態性與抑郁癥自殺未遂的關聯研究[J].中國神經精神疾病雜志,2007,33:103-105.

[5] 陳壯飛,曾 勇,許秀峰,等.云南漢族、基諾族色氨酸羥化酶2基因rs1386494、G1463A多態性與精神分裂癥的關聯研究[J].中華臨床醫師雜志,2009,3(1):72-82.

[6] Stacey A S,Timothy J G,David M T,et al.Differential tissue distribution of try ptophan hydroxylase isoforms 1 and 2 as revealed with monospecific antibodies[J].Brain Research,2006,1085:11-18.

[7] 張秀劼,曾 勇.色氨酸羥化酶2與精神疾病的分子遺傳學研究[J].醫學綜述,2008,14(12):1791-1793.

[8] 王樹俊,曹新廣,陳小兵,等.RT-PCR法檢測SHH和PTCH在食管鱗狀細胞癌中的表達[J].臨床腫瘤學雜志,2009,14(2):115-117.

[9] 金海敏,孟慶勇.半定量RT-PCR法檢測T LR4在人大腸癌中的表達[J].現代實用醫學,2009,21(7):682-684.

[10] 彭曉玲,蘭 玲,馬亞珍,等.高致病性禽流感RT-PCR快速診斷方法的建立[J].動物醫學進展,2009,30(1):40-42.

[11] 文英會,崔保安,劉內生,等.一例豬流感的RT-PCR診斷[J].中國畜牧獸醫,2009,36(1):102-103.

[12] 勞荃蘅,黃錫霞,田可川,等.用半定量RT-PCR法檢測BⅢB4基因在綿羊皮膚組織中的mRNA表達[J].新疆農業科學,2009,46(2):443-448.