DBA/1小鼠膠原性關節炎模型建立方法及評價指標

張玲玲，劉云潔，童 彤，吳穎其，趙文娣，李培培，魏 偉

(安徽醫科大學臨床藥理研究所·抗炎免疫藥理學省部共建教育部重點實驗室·抗炎免疫藥物安徽省工程技術研究中心，安徽合肥 230032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以損害滑膜、軟骨和骨的一種慢性、炎性、系統性的自身免疫性疾病［1］。小鼠膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis，CIA)是用于闡明關節炎發病機制及研究新的治療藥物的RA動物模型［2］。CIA模型是Trentham等1977年首次建立的實驗性關節炎動物模型，20世紀80年代至90年代初期，國外大量重復實驗并在臨床表現、病理組織學和免疫學等方面進行了廣泛深入的研究。雞、小牛、大鼠的Ⅱ型膠原(typeⅡcollagen，CⅡ)均能引起關節炎。選擇的動物一般為嚙齒類和靈長類［3］。本文描述了雞CⅡ免疫DBA/1小鼠誘導關節炎模型的方法及評價CIA模型的主要指標，包括關節炎指數、體重、足爪X線、踝關節及脾臟病理觀察及評分等。與以往的CIA模型建立方法比較，本實驗中CIA建立方法可靠，重復性好，CIA發病率高。該方法及評價指標將為建立CIA模型研究RA病理機制及評價RA治療藥物提供實驗依據。

2 材料與方法

2.1 動物DBA/1小鼠(7～8周)，♂性，體質量(18+2)g，SPF級，購自中國科學院上海藥物研究所，合格證號:SCXK(滬)2008-0017。

2.2 藥物和試劑卡介苗:北京生物制品所產品，批號20090324;Ⅱ型膠原:Sigma公司(No 9007－34－5);完全弗氏佐劑(CFA):Sigma公司，含卡介苗(1 g·L－1)。

2.3 實驗分組DBA/1小鼠，隨機分為2組，即正常組、模型組，每組10只。

2.4 CIA模型的制備［4］于d 0，每只小鼠尾根部、背部多點(4～5點)皮內注射100 μg雞CⅡ和完全弗氏佐劑［CFA，含卡介苗(1 mg·ml－1)，共 0.1 ml］。d 21，尾根部、背部多點皮內注射同等劑量的該乳劑作為激發。

2.5 檢測指標:

2.5.1 大體指標觀察 (1)全身病變:每周測量體重變化，觀察前后足爪病變的發生情況。(2)關節炎指數［5］:第一次免疫后，每隔3 d，進行關節炎指數評分。按0～4五級評分，0=無紅腫;1=小趾關節稍腫;2=趾關節和足跖腫脹;3=踝關節以下的足爪腫脹;4=包括踝關節在內的全部足爪腫脹。

2.5.2 踝關節 X 片［6］在致炎 d 70，脫臼處死小鼠，剪下包括踝關節在內的四肢足爪進行X線攝片(Revolution XR/d型數字化X線成像儀:GE公司)，觀察有無骨質溶解和骨贅形成等。

2.5.3 踝關節和脾臟病理學觀察［7］

2.5.3.1 踝關節病理檢查及病理學評分 處死小鼠，取后足炎性踝關節進行HE染色，觀察組織病理變化，并進行病理評分。踝關節病理分別從滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質侵蝕評分。

①滑膜細胞增殖評分:0=無增殖;1=輕微增殖，2～4層滑膜細胞;2=中度增殖，4層以上滑膜細胞;3=滑膜細胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關節間隙消失。

②細胞侵蝕評分:0=無侵蝕;1=較少的局部侵蝕;2=廣泛的局部侵蝕;3=廣泛侵蝕到關節囊，伴有凝聚體的形成。

③血管翳評分:0=無改變;1=兩個部位出現血管翳;2=4個部位出現血管翳，伴有軟骨表面的侵蝕;3=4個以上部位出現血管翳或二個部位出現大范圍的血管翳。

④炎癥評分:0=正常;1=輕度炎癥，出現1個聚集物或較少的分散白細胞浸潤;2=中度炎癥，2個或2個以上的白細胞聚集物;3=重度炎癥，白細胞融合、分散浸潤明顯。

⑤骨質侵蝕評分:0=正常;1=小量侵蝕，1～2個小的淺部位;2=少量侵蝕，1～4個中等大小和深度部位;3=中等侵蝕，5個以上部位，局部侵蝕到骨皮質;4=重度侵蝕，多重損傷，局部或完全侵蝕到骨皮質;5=廣泛損傷，皮質穿透骨長度的25%以上。

2.5.3.2 脾臟病理檢查及病理學評分 處死小鼠，取脾臟進行HE染色，觀察組織病理變化，并進行病理評分。脾臟病理從動脈周圍淋巴鞘的細胞密度、淋巴小結增生(淋巴樣濾泡)、邊緣區增生、紅髓充血和生發中心的總數量進行判定，按照病變從輕到重進行0～3(0=正常)級病理評分。

①動脈周圍淋巴鞘的細胞密度評分:0=正常;1=細胞密度輕微增大;2=細胞密度中度增大，有細胞擁擠;3=細胞密度重度增大，有細胞擁擠疊加。

②淋巴小結增生評分:0=無增生，生發中心極少或無;1=輕微增生，可見生發中心;2=中度增生，生發中心明顯;3=過度增生，細胞密度增大，生發中心多見。

③ 邊緣區增生評分:0=無增生，混有少量紅細胞;1=輕微增生，邊緣區輕度增寬;2=中度增生，邊緣區明顯增寬，紅細胞減少;3=重度增生，與白髓界限模糊。

④ 紅髓充血評分:0=無充血;1=輕微充血，脾臟血量輕度最多;2=中度充血;紅髓中固有的細胞成分減少，在小梁或被膜附近可見一些被血液排擠的淋巴組織;3=脾髓內充盈大量血液，紅髓中固有的細胞成分大為減少，小梁或被膜附近明顯可見被血液排擠的淋巴組織。

2.6 統計學處理數據分析應用SPSS 11.5和SAS 8.02軟件處理，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

3 結果

3.1 肉眼觀察CIA小鼠前后足爪病變情況d 0將CⅡ乳劑于DBA/1小鼠的尾根部皮內注射0.1 ml致炎，d 21將相同劑量CⅡ乳劑0.1 ml在尾根部皮內注射，作為激發。d 31小鼠足爪出現紅腫，首先是前足紅腫，以后延伸到后足，有的表現為足掌紅腫，有的表現為趾指紅腫，似梅花狀。d 40～60為腫脹高峰，d 70后，足爪腫脹仍然存在(Fig 1A，B)。

Fig 1 Swelling paws in mice with CIA

3.2 CIA小鼠體重變化小鼠免疫后，每周測定小鼠體重，觀察體重變化，d 35開始，CIA組小鼠體重開始下降，體重增加值與正常組體重增加值比較，差異有顯著性，一直持續到d 70(Fig 2)。

Fig 2 Weight change in mice with CIA

3.3 CIA小鼠關節炎指數評分情況第一次免疫后，每隔3天，進行關節炎指數評分。d 31，CIA小鼠足爪出現紅腫，關節炎指數均值為3.44，隨著病程延長，關節炎指數逐漸升高，在 d 47～63，指數均值達7.0左右(Fig 3A，B)。

3.4 CIA小鼠足爪X片改變d 70，脫臼處死小鼠，取下小鼠包括踝關節在內的前后足爪，進行X線射片。與正常組比較，CIA組小鼠足爪關節變形，有骨贅生成，伴有骨質溶解(Fig 4A，4B)。

3.5 CIA小鼠踝關節病理變化及評分d 70，脫臼處死小鼠，取足爪踝關節，進行HE染色，觀察組織病理變化。正常小鼠滑膜組織無增生，襯覆1－2層滑膜細胞，無炎細胞浸潤，無血管擴張充血，無血管翳;CIA小鼠踝關節明顯可以看到滑膜組織增生，襯覆多層滑膜細胞，炎細胞浸潤，血管擴張充血，血管翳出現(Fig 5A，5B)。分別對正常組和CIA組小鼠踝關節病理從滑膜細胞增殖、細胞侵蝕、血管翳形成、炎癥和骨質侵蝕進行評分，結果顯示正常組小鼠各指標病理評分為0，CIA組小鼠各指標病理評分均值明顯增高(Tab 1)。

3.6 CIA小鼠脾臟病理變化及評分d 70，脫臼處死小鼠，分離脾臟，進行HE染色，觀察組織病理變化。與正常組比較，CIA組小鼠脾臟生發中心增多，白髓淋巴樣濾泡增生明顯，邊緣區細胞密度增大、紅髓淤血(Fig 6A，6B)。同時從動脈周圍淋巴鞘的細胞密度、淋巴小結(淋巴樣濾泡增生)、邊緣區細胞密度、紅髓淤血和生發中心總數量，按照病變從輕到重進行0～3(0=正常)級病理評分。結果顯示CIA組小鼠脾臟病理各指標分值均值明顯高于正常組小鼠(Tab 2)。

4 討論

CIA小鼠表現為多發性外周關節炎，關節局部紅腫，嚴重致關節畸形。病理變化為增生性滑膜炎，關節軟骨破壞、骨侵蝕，伴有炎性細胞浸潤。體內可檢出針對自身Ⅱ型膠原的高滴度的IgG抗體。這些臨床表現及實驗室指標與人RA密切相關，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型［3，8］。

Tab 1 Histological pathology scores of ankle joints in CIA mice(+s，n=10)

Tab 1 Histological pathology scores of ankle joints in CIA mice(+s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs normal

Group Synovial hyperplasia Cell infiltration Pannus Inflammation Bone erosion Normal 0 0 0 0 0 CIA 2.77 ±0.61＊＊ 1.95 ±0.84＊＊ 2.36 ±1.09＊＊ 1.77 ±0.81＊＊ 1.13 ±1.03＊＊

Tab 2 Histological pathology scores of spleen in CIA mice(+s，n=10)

Tab 2 Histological pathology scores of spleen in CIA mice(+s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs normal.

Group Germinal center Cell density lymphatic sheath Lymphoid follicular hyperplasia Marg inal zone Red pulp Normal 1.82 ±1.40 0.92 ±0.51 1.08 ±0.67 0.67 ±0.49 0.42 ±0.15 CIA 4.25 ±1.48＊＊ 2.05 ±0.82＊＊ 2.45 ±0.60＊＊ 2.00 ±0.65＊＊ 2.50 ±0.69＊＊

Fig 3 Scores of arthritis index in mice with CIA

Fig 4 Paw X-ray photos in mice with CIA

Fig 5 Histological pathology of ankle joints in CIA mice(HE staining，×100).

Fig 6 Histological pathology of spleen tissue in CIA mice(HE staining，×40).

DBA近交系小鼠，是所有近交系小鼠中最早的，1909年Little博士曾在毛色遺傳實驗中使用。1929～1930年培育成幾個品系，美國杰克遜實驗室目前培育有DBA/1和DBA/2等亞系。DBA/1小鼠被廣泛用于建立RA模型，用II型膠原蛋白免疫可引起自身免疫反應，導致嚴重的多發性關節炎。DBA/1小鼠誘導CIA的發病率高，在90%左右，小于100%。DBA/1小鼠CIA顯示滑膜炎、軟骨和骨侵蝕等病理變化，類似于人 RA 的臨床病理改變［9－10］。

本實驗中我們以雞CⅡ免疫7～8 wk♂性DBA/1小鼠。免疫后d 31，小鼠足爪出現紅腫，首先是前足紅腫，延伸到后足，并伴有體重下降，關節炎指數隨著病程延長，逐漸升高。CIA小鼠足爪X線片顯示足爪關節變形，有骨贅生成，伴有骨質溶解。CIA小鼠足爪踝關節病理明顯可以看到滑膜組織增生，襯覆多層滑膜細胞，炎細胞浸潤，血管擴張充血，血管翳出現。CIA小鼠脾臟病理可見生發中心增多，白髓淋巴樣濾泡增生明顯，邊緣區細胞密度增大、紅髓充血。這些病理改變及體征與文獻報道一致。

總之，雞CⅡ免疫DBA/1小鼠誘導CIA動物模型，其病理改變和體征較大程度反映了RA的發病情況，該方法可靠，重復性好，CIA發病率高。關節炎指數、足爪X線片、踝關節和脾臟病理等是評價CIA模型的主要指標。本實驗描述的DBA/1小鼠建立CIA的主要方法和主要評價指標，為進一步了解RA致病機制和評價新藥提供了重要的實驗依據。

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