NVP-AAM077和Ro25-6981對全腦缺血小鼠海馬神經元損傷及BDNF表達的影響

陳遠壽，羅孝美，陳 旻，張 弛

(1.遵義醫學院生理學教研室，貴州 遵義 563003;2.中國科學院神經科學研究所神經科學國家重點實驗室，上海 200031)

缺血性腦卒中是臨床常見的急性腦血管病，具有高發病率、高致殘率、高病死率的特點，是中老年人致死和致殘的主要疾病。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR or NR)介導的谷氨酸神經興奮毒性在缺血性腦損傷的眾多環節中起著關鍵性的作用，它是由不同亞單位(功能亞單位NR1和調節亞單位NR2A～NR2D)組成的異聚體［1］。近來研究表明［2，3］，大鼠海馬 NR2A 和NR2B在缺血性腦損傷中可能起著不同的作用。但NR2A和NR2B亞基在腦缺血性損傷發展進程中的作用及分子機制，目前尚未完全清楚。本文以小鼠全腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型為研究對象，用特異性NR2A和NR2B的拮抗劑處理，探討NR2A和NR2B在小鼠海馬神經元缺血損傷中的作用及可能機制，為進一步研制和開發針對NR2A與NR2B的特異性新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品NVP-AAM077(NR2A特異性性拮抗劑)由中國科學院上海生命科學院藥物研究所合成，先前的研究已證實了其特異性［3，4］;Ro25-6981(NR2B特異性拮抗劑)購自Sigma公司;兔抗BDNF多克隆抗體和兔抗β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動物分組48只♂C57BL/6小鼠，體重20～25 g(由中國科學院上海斯萊克實驗動物中心提供)，隨機分為假手術組(sham group)、腦缺血/再灌注對照組(I/R control group)、NVP-AAM077干預組(NVP+I/R group)和Ro25-6981干預組(Ro+I/R group)。每組12只。兩干預組小鼠于缺血前30 min腹腔內分別注射NVP-AAM077(5.0 mg·kg－1)和Ro25-6981(6.0 mg·kg－1)，sham 組和 I/R 對照組在術前30 min注射等容量生理鹽水。

Fig 1 Effect of NVP-AAM077 or Ro25-6981 on the neuron loss induced by transient global ischemia

1.3 小鼠全腦缺血/再灌注模型的制作參照文獻［5］制備三血管阻塞(3-VO)全腦缺血模型。小鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i.p.)麻醉后，在解剖顯微鏡下分離出兩側頸總動脈和基底動脈，分別用小動脈夾夾閉雙側頸總動脈和用微型動脈夾(用直徑為0.2 mm的不銹鋼鋼絲制作而成，日本東京FUJITA醫療器械有限責任公司定制)夾閉基底動脈，在顯微鏡下證實動脈血流被阻斷，造成小鼠全腦缺血12 min后，置小鼠于30℃的恒溫保育箱內進行再灌注3 d，在手術造模和再灌注期間均應監測小鼠體溫，使之維持在37℃左右。Sham組小鼠進行同樣的手術處理，但不進行三血管阻塞。

1.4 Fluoro-Jade B(FJB)染色海馬冠狀冰凍切片(20 μm)，浸入100%乙醇5 min，70%乙醇2 min，ddH2O 2 min，0.06%KMnO415 min，ddH2O 1 min，避光下0.000 5%FJB儲液20 min(美國Histo-Chem公司)，ddH2O 1 min×3，室溫干，DPX封片。熒光顯微鏡(日本Nikon公司)下觀察海馬神經元細胞變性死亡情況。

1.5 Nissl染色海馬冠狀冰凍切片(20 μm)，浸入1∶1乙醇和氯仿溶液中 30 min，梯度乙醇(100%、95%、80%、70%、60%、50%)分化，蒸餾水沖洗后用甲酚紫染液浸染30 min，蒸餾水洗，用梯度乙醇(50%、60%、70%、80%、95%、100%)脫水，二甲苯透明(5 min1次×2次)，DPX封片，顯微鏡明場下觀察海馬神經元形態學變化。各組選取切片6張，在顯微鏡下對海馬CA1區存活神經元計數分析。

1.6 腦源性神經生長因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表達的檢測參照文獻［6，7］行 Western blot，其中一抗為兔抗 BDNF(1 ∶1 000)，二抗為辣根過氧化物酶標記的抗小鼠二抗(1∶2 000)，膠片曝光顯影后，結果以β-actin作為內參進行定量分析。

1.7 統計學分析實驗數據以±s表示，采用SPSS 11.5統計對數據進行分析，組間樣本定量資料比較應用One-way ANOVA分析。

2 結果

2.1 特異性NR2A和NR2B拮抗劑對腦缺血小鼠海馬神經元損傷的影響sham組小鼠海馬神經元未見F-JB陽性細胞，I/R組、NVP和Ro干預組在腦缺血12 min/再灌注3 d后海馬CA1區神經元出現FJB陽性細胞，表明CA1區神經元出現了遲發性變性死亡;同時，Nissl染色和定量分析顯示，與sham組比較，I/R組、NVP和Ro干預組CA1區神經元存活數量均減少(P＜0.01或P＜0.05);Ro干預組CA1區神經元存活數量明顯多于I/R組(P＜0.01)，NVP干預組CA1區神經元存活數量明顯低于I/R組(P＜0.05)，見Fig 1。

2.2 特異性NR2A和NR2B拮抗劑對腦缺血小鼠海馬BDNF表達的影響Western blot結果顯示，I/R組和Ro干預組海馬組織BDNF蛋白表達與sham組相比均明顯增加(P＜0.01);NVP干預組的BDNF蛋白表達明顯低于I/R組(P＜0.01)，而Ro干預組BDNF蛋白表達高于與I/R組(P＜0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effect of NVP-AAM077 or Ro25-6981 on the expression of BDNF in the hippocampus of transient global ischemia mice

3 討論

腦缺血/再灌注后，興奮性谷氨酸過度激活NMDA受體導致神經元胞內鈣超載而觸發的系列生化改變和誘導相關基因的表達可能是導致神經元損傷的重要原因［1，8－9］，而該受體通道的調控在缺血性腦卒中的治療中可能是重要的靶點。NMDA受體主要由NR1、NR2(NR2A-NR2D)和NR3亞基組成，功能性的 NMDA 受體由 NR1和 NR2共同組成［1－3］。NR2亞基在缺血性腦損傷中起著非常重要的作用，尤其是NR2A和NR2B在腦缺血和預缺血耐受中可能有不同的作用。NR2A和NR2B的亞細胞定位不同決定了它們在腦缺血/再灌注后所起的作用不同，NR2A主要分布在成熟神經元的突觸上，而NR2B則主要分布于突觸外的細胞膜上［10－11］，研究表明，激活突觸上的NMDA受體促進神經元存活，而激活突觸外的NMDA受體會導致神經元細胞死亡［12－13］。Chen 等［3］研究發現，阻斷大鼠的 NR2A后可削弱預缺血耐受的神經元保護作用，抑制CREB的磷酸化及其下游基因cpg15和BDNF mRNA的表達，而阻斷NR2B后起相反的作用。本研究發現，應用NVP-AAM077阻斷小鼠的NR2A后，加重了腦缺血引起的海馬CA1區神經元死亡，而用Ro25-6981阻斷NR2B后，可明顯減輕腦缺血引起的海馬CA1區神經元死亡。提示NR2A和NR2B在小鼠腦缺血引起神經元損傷中起著不同的作用。

BDNF是腦中含量最多的神經營養因子，具有調節神經系統發育、成熟、維持神經元生長的功能。研究表明［3，6，14］，腦 缺 血損傷 時，BDNF 及 其受體TrkB表達均增加，對受損細胞的存活、生長以及恢復有著重要的作用。本研究顯示，在腦缺血早期，海馬BDNF蛋白表達上調，現在認為這可能是一種缺血引起的反應性上調，是對缺血損傷做出的保護性反應，有利于受損細胞的存活、生長及修復;阻斷NR2A可下調小鼠海馬組織BDNF蛋白的表達，導致存活細胞減少，而阻斷NR2B可上調小鼠海馬組織BDNF蛋白的表達，使細胞存活增加，這可能就是NR2A和NR2B在小鼠腦缺血引起神經元存活和死亡中起著不同作用機制之一。

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