ZX-5對一氧化氮合酶表達和活性的調節作用

魏 晉，潘 麗，張奕華，徐寒梅

(中國藥科大學1.生命科學與技術學院、2.藥學院，江蘇南京 210009)

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種常見的能夠導致視力衰弱或致盲的老年性眼科疾病，僅美國就有1千萬患者，在中國人數更多，約5 000萬以上［1-2］。AMD的特征性表現是黃斑區出現玻璃疣，伴有脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成或地圖樣萎縮斑。在2/3以上的AMD患者中，CNV產生的主要原因是早期的脈絡膜循環障礙，要預防或阻止它的發生，必須改善和促進脈絡膜血流［3-4］。病理學研究發現，在AMD患者的脈絡膜血管和脈絡膜血管細胞中內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達有明顯的減少，而神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)無明顯變化［5］，這表明 eNOS 表達量和一氧化氮(NO)釋放量的減少是AMD的形成一個重要原因。研究表明NO是調控眼脈絡膜血流的一個重要因子，它能夠舒張血管平滑肌，增加血流，減少脈絡膜新生血管形成［3-5］，因此，NO調控劑在治療CNV形成和AMD疾病上有著重要的意義。

Fig 1 The chemical structure of ZX-5

本課題組張奕華教授設計合成了200多個NO調控劑，經美國德州農工大學(A＆M Univ.)醫學中心眼科研究所所長邱春憶教授等篩選，發現其中的化合物(R，R)ZX-5(10 g·L-1)能明顯增加新西蘭白兔脈絡膜血流，但對其虹膜和睫狀體血流沒有影響。(R，R)ZX-5為順式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-［4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環-2-基］苯基}硫脲。而且，該化合物的反式結構，即(S，S)ZX-5卻不能夠促進新西蘭白兔的脈絡膜血流［4］。這說明促進脈絡膜血流是(R，R)ZX-5特有的功能。由于3種一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在眼部脈絡膜血管中都有表達，動物實驗并沒有闡明ZX-5通過調控哪種NOS的酶活，發揮促進脈絡膜血流的作用;因此，我們將通過體外研究闡明ZX-5對血管內皮細胞中的3種NOS表達和活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料ZX-5由本課題組張奕華教授設計并合成，分子結構見Fig 1;人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自美國Sciencell Research Laboratories;NOS和βactin一抗購自美國Santa Cruz公司;二抗購自聯科生物分裝Multi Sciences;PVDF轉印膜購自美國Millipore公司;通用蛋白裂解試劑盒購自上海生物工程有限公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海欣百諾生物科技有限公司;NOS活性檢測試劑盒購自南京建成生物科技公司;ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所;X膠片、顯影液、定影液購自武漢博士徳生物工程有限公司;其它試劑均為分析純。752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司，上海);VE-180垂直電泳儀(上海天能科技有限公司，上海);DYCZ-40D型蛋白轉移電泳儀(北京六一儀器廠，北京)。

1.2 細胞培養HUVEC細胞培養在37℃、5%CO2的培養箱，培養液為Sciencell Research Laboratories專用內皮細胞專用培養液，含有5%胎牛血清(FBS)、內皮細胞生長因子(ECGs)、青霉素和鏈霉素。用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞后，以3×105每孔接種到6孔板中，鋪板24 h后給藥(R，R)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)、(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)和DMSO作為陰性對照，每組6個重復。

1.3 蛋白抽提和蛋白定量給藥12 h后，棄去培養液用冰冷的PBS洗滌，再用含有1 mmol·L-1的0.25%胰酶消化離心收集細胞，用每孔60 μl通用蛋白裂解液在冰上裂解細胞。4℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。蛋白濃度測定:每孔取3 μl蛋白樣品，根據Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書要求測定蛋白含量。

1.4 Western blot分析NOS蛋白蛋白樣品加入上樣緩沖液后用10%的SDS-PAGE凝膠分離，而后轉印到PVDF膜上;轉印膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，經過TBST洗膜后加入一抗，在4℃條件下孵育過夜;經過TBST洗膜后加入相應的辣根過氧化酶標記的二抗，孵育4 h;TBST洗膜后用ECL試劑盒曝光檢測的NOS表達變化。

1.5 NOS活性檢測試劑盒檢測 NOS的活力NOS催化L-Arg和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質生成有色化合物，在530 nm波長下測定吸光度，根據吸光度的大小可計算出NOS的活力。待測蛋白樣品分為總NOS活力測定組和NOS分型活力測定組，加入底物緩沖液，促進劑，顯色液，其中NOS分型活力測定組加入相應的抑制劑后37℃水浴準確反應15 min后加入透明劑和終止液終止反應、混勻，在530 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零，測各管的吸光度值。用每毫克蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個酶活力單位。

2 結果

2.1 ZX-5上調iNOS蛋白表達量ZX-5能夠增加iNOS蛋白表達量，Western blot結果見Fig 2A。iNOS蛋白表達量變化用軟件對條帶比較分析，用iNOS/β-actin的比值表示，計算iNOS蛋白相對表達水平，結果見Fig 2B。結果顯示和陰性對照相比，(R，R)ZX-5和(S，S)ZX-5都能夠增加iNOS蛋白表達量，其中(R，R)ZX-5能少量的上調iNOS的表達(對應給藥質量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，iNOS 上調率3.4%、4.2%和 3.9%)，而(S，S)ZX-5 能夠比較明顯地上調iNOS表達(對應給藥質量濃度7.5、15和30 mg · L-1，iNOS 上調率2.8%、34.1% 和39.7%)。

Fig 2 AiNOS expression in ZX-5 induced HUVECsFig 2B Effects of ZX-5 on up-regulating iNOS expression

2.2 ZX-5不影響nNOS蛋白表達量ZX-5不影響nNOS蛋白表達量，Western blot結果見Fig 3A。nNOS蛋白表達量變化用軟件對條帶比較分析，用nNOS/β-actin的比值表示，計算nNOS蛋白相對表達水平，結果見Fig 3B。結果顯示和陰性對照相比，(R，R)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)和(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)都不能影響nNOS蛋白表達量。

Fig 3 AnNOS expression in ZX-5 induced HUVECs;Fig 3B Effects of ZX-5 on nNOS expression

Fig 4 AeNOS expression in ZX-5 induced HUVECs;Fig 4B Effects of ZX-5 on eNOS expression

2.3 (R，R)ZX-5上調 eNOS蛋白表達量ZX-5這對異構體對eNOS蛋白表達量的影響不同，Western blot結果見Fig 4A。eNOS蛋白表達量變化用軟件對條帶比較分析，用eNOS/β-actin的比值表示，計算eNOS蛋白相對表達水平，結果見Fig 4B。結果顯示和陰性對照相比，(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)不能影響eNOS蛋白表達量，但是(R，R)ZX-5卻能夠增加eNOS蛋白表達量(對應給藥的質量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，eNOS 上調率 4.1%、17.9%和 16.7%)。

2.4 (S，S)ZX-5 上調 iNOS 的活力(S，S)ZX-5能夠上調iNOS蛋白活力，iNOS酶活測定結果見Fig 5。iNOS的酶活變化用iNOS活力檢測試劑盒測定，并根據試劑盒說明書表示酶活。和陰性對照相比，(S，S)ZX-5能夠增加iNOS酶活(對應給藥的質量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，NO 產量的上調率 3.9%、12.9%和 24.9%);而(R，R)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)不能夠增加iNOS酶活，產生大量的NO。

Fig 5 Effects of ZX-5 on influencing iNOS activity in HUVECs(±s)

2.5 ZX-5不改變 nNOS酶活給藥 ZX-5后的nNOS的酶活變化用nNOS活力檢測試劑盒測定，并根據試劑盒說明書的要求表示酶活。nNOS酶活測定結果見 Fig 6。和陰性對照相比，(R，R)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)和(S，S)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)都不能夠改變nNOS酶活。

2.6 (R，R)ZX-5上調 eNOS酶活(R，R)ZX-5能夠上調eNOS酶活，eNOS酶活測定結果見Fig 7。eNOS的酶活變化用eNOS活力檢測試劑盒測定，并根據試劑盒說明書表示酶活。和陰性對照相比，(R，R)ZX-5能夠增加eNOS酶活(對應給藥濃度7.5、15、30 mg·L-1，NO 產量的上調率 14.4%、22.7%和28.2%);而(S，S)ZX-5(給藥 7.5、15、30 mg·L-1)對eNOS酶活性影響不明顯。

3 討論

Fig 6 Effects of ZX-5 on changing nNOS activity in HUVECs

Fig 7 Effects of ZX-5 on changing eNOS activity in HUVECs

哺乳動物體內有3種NOS，它們盡管主要分布的組織不同，但是在血管內皮細胞中都會表達［6-8］。在本次研究中，我們首先檢測了ZX-5對nNOS表達的影響，發現ZX-5對血管內皮細胞中的nNOS的表達和酶活都沒有明顯影響。nNOS釋放的NO主要發揮細胞間信號傳遞的功能，這表明ZX-5不會通過影響nNOS的酶活而增加NO釋放量，即該化合物不通過調控nNOS的酶活，增加脈絡膜血流。

iNOS在正常情況下很少表達，只有在機體發生病變時或者受到外界刺激時才會表達，進而產生NO;但是iNOS產生NO過程持續的時間比較久，會對生物體產生危害［8-9］，例如在一系列眼部疾病中就有因iNOS表達而長時間地產生NO的現象［3］。本研究發現(R，R)ZX-5和(S，S)ZX-5均能夠不同程度地上調iNOS表達，而僅僅(S，S)ZX-5能誘導iNOS產生少量NO。究其原因，可能ZX-5是小分子化合物，因而不會像病原體一樣能夠激活iNOS產生大量的NO。不過，盡管(S，S)ZX-5能夠通過激活iNOS產生少量的NO，但由于iNOS一旦誘導就會較長時間的釋放NO，而對眼部產生一定危害，所以(S，S)ZX-5不具有開發出來治療AMD的潛力。

和iNOS不同，eNOS在正常情況下也在脈絡膜血管內皮細胞中表達，通過調控NO的釋放，發揮調控血管舒張和血流的功能;而且該酶在受到外界刺激信號時，也會在短時間地釋放NO，產生特定生理功能［4，10］。本研究發現(S，S)ZX-5 不影響 eNOS 的酶活和NO的釋放，但(R，R)ZX-5能夠上調eNOS蛋白表達和酶活，增加NO的釋放，這說明(S，S)ZX-5和(R，R)ZX-5的立體結構差異對eNOS的調控有著巨大的區別。eNOS活性受到包括乙酰化、蛋白相互作用、細胞內的信號轉導途徑、蛋白質的磷酸化等等在內的復雜的轉錄后水平的調控［11］。為了闡明(R，R)ZX-5通過哪些途徑調節eNOS的活性，我們正在進行相關的研究。

本研究結果表明，盡管在內皮細胞中3種NOS都會表達，但是(S，S)ZX-5能通過上調iNOS表達和酶活較長時間地釋放NO，進而對機體產生不良的影響。(R，R)ZX-5卻能夠通過上調內皮細胞中的eNOS蛋白表達和酶活，增加NO釋放量，促進脈絡膜血流，從而發揮預防和治療AMD眼病的作用。

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