丹參素異丙酯對離體大鼠缺血/再灌注損傷心肌的影響

程亮星，岳云宵，王世祥，南葉飛，鄭曉暉，戚 敏，于 爽，付潤芳

(1.鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室，河南鄭州 450052;2.西北大學生命科學學院，陜西西安 710069)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)就是心肌在恢復血流以后即心肌得到血液再灌注后，不僅功能未得到恢復，反而使心肌損傷加重，出現心律失常、梗死面積擴大等［1］。其機制主要有:鈣超載、氧自由基和活化的中性粒細胞的作用及急性炎癥反應等［2－3］。因此，如何防止鈣超載、抗氧化、清除自由基、改善細胞能量代謝、調動內源性保護機制等［4］，成為當今研究的熱點問題。有關報道［5］表明復方丹參滴丸(CDDP)具有抗MIRI作用。丹參素異丙酯(IDHP)是由本課題組前期采用代謝組學技術對復方丹參方研究過程中發現的一種體內代謝物［6］，其是否也具有相同的作用尚未有人研究。本研究采用Langendorff灌流技術制備離體大鼠MIRI模型，探討IDHP對大鼠MIRI的影響，擬從能量代謝及心肌細胞超微結構兩個角度探討IDHP對其影響機制，以期為臨床治療MIRI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)及一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)3種物質的鈉鹽均購自Amresco公司，批號分別為:0220、0160、0634;IDHP由西北大學中草藥現代化研究及工程中心提供，批號:2006－2;CDDP購自天津天士力制藥股份有限公司，批號:20061008;其他試劑均為國內分析純。

1.1.2 主要儀器 Langendorff灌流裝置(自制);日本島津LC-6A型高效液相色譜儀、SPD-6A型紫外檢測器，日本島津公司產品;Scienhome C18色譜柱(250 nm×4.6 nm，5 μm)，江蘇淮安市恒天公貿有限公司產品;H－7500透射電鏡，日本日立公司產品。

1.1.3 實驗動物 健康Wistar大鼠，體質量290～320 g，♀♂不限，由河南省實驗動物中心提供。動物合格證號:SCXK(豫)2005－0001。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心臟灌流模型的建立［7］各組大鼠用質量分數1%的戊巴比妥鈉(0.4 μl·g－1)腹腔注射麻醉，同時腹腔注射質量分數1%的肝素鈉(0.2 μl·g－1);常規開胸取出心臟，放入盛有 0 ～4℃預冷灌流液的平皿內，用預冷灌流液沖掉殘留血液，迅速連接到Langendorff灌流裝置上開始灌流。灌流壓為88 kPa;灌流液為Krebs-Hanseleit磷酸緩沖液，其組成為(mmol·L－1):NaCl 118.0，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，CaCl222.5，Glucose 11.0，pH 7.4，滲透壓 300 mOsm·L－1;灌流前以體積分數95%O2+體積分數5%CO2混合氣平衡15 min，灌流中持續通氣;在灌流過程中，保持灌流液在37℃。

1.2.2 實驗分組及用藥方法 80只Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照藥(CDDP 50.00 mg·L－1)前保護及后保護組、IDHP 4.00 mg·L－1和0.04 mg·L－1兩個劑量的前保護及后保護組，共8組，每組10只。空白對照組:持續灌流75 min;模型組:預灌15 min，37℃條件下停灌40 min，復灌20 min;各用藥組:分別在預灌或復灌時加入相應的藥物，濃度分別為 50.00、50.00、4.00、4.00、0.04、0.04 mg·L－1，其他處理同模型組。

1.2.3 心肌高能磷酸化合物(high energy phosphates，HEP)含量測定 灌流結束后，剪取左心室，立即用液氮預冷的金屬夾板夾成冰凍薄片，放入液氮中待測。每例心肌標本稱取100 mg，加入預冷的0.42 mol·L－1高氯酸制成勻漿;加入 1.00 mol·L－1氫氧化鉀中和;超聲波細胞粉碎器將線粒體膜粉碎，使能量物質全部釋放于溶液中;以上操作過程均在冰水中進行。4℃、15 000 r·min－1離心15 min;取上清液用0.2 μm微孔濾膜過濾;吸取20 μl濾液上柱分析以測定能量物質變化，色譜條件:流動相為215 mmol·L－1KH2PO4與3.5%乙腈組成，三乙胺調pH值至6.1，流速為0.5 ml·min－1，檢測波長為210 nm，柱溫30℃。

1.2.4 心肌超微結構的觀察 灌流結束后，在0℃～4℃的4%戊二醛－磷酸緩沖液中，從心臟左室游離壁處剪取1 mm×1 mm×3 mm的小塊，放入預冷的4%戊二醛－磷酸緩沖液中，4℃固定8 h，經脫水、包埋、超薄切片、染色后在電鏡下觀察心肌細胞超微結構。

1.3 統計學處理采用統計學軟件SPSS 13.0進行統計分析，計量資料數據用±s表示，進行方差齊性檢驗，采用單因素方差分析進行檢驗，組間用LSD法進行兩兩比較;不適合方差分析者，用Mann-Whitney U法進行非參數檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HEP含量與空白對照組相比，模型組的ATP、ADP、AMP及腺嘌呤核苷酸總量(total adenine nucleotides，TAN)明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組相比，各用藥組的ADP、AMP及TAN明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);與模型組相比，CDDP 50.0 mg·L－1前保護和后保護組、IDHP 4.00 mg·L－1前保護和后保護組的ATP含量明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05);IDHP 0.04 mg·L－1前保護和后保護組的ATP含量與模型組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，見 Tab 1。

2.2 心肌細胞超微結構觀察結果空白對照組心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，心肌細胞核膜和線粒體膜完整，染色質均勻、細密，線粒體基質致密，嵴排列緊密整齊，線粒體和糖原顆粒豐富，見Fig 1;模型組心肌細胞超微結構損傷最嚴重，心肌細胞有少量輕度壞死區肌節排列紊亂或消失，核的一端基質明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，線粒體和糖原數量明顯減少，見Fig 2;CDDP 50.00 mg·L－1前保護、后保護組及 IDHP 4.00 mg·L－1前保護、后保護組超微結構與空白對照組相似，損傷較輕，見 Fig 3～6;與模型組相比，IDHP 0.04 mg·L－1前保護、后保護組心肌細胞超微結構的損傷有所改善，但仍較嚴重，見Fig 7、8。

3 討論

心臟是一個高度需氧和耗能的器官，其能量主要來源于脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化產生的ATP，ATP等能量物質的充分供應是維持心肌細胞正常功能和完整結構的保證。因此，當心肌缺血時，恢復血流成了首要任務，然而恢復血流后通常會出現損傷加重的現象，即MIRI，這也是一些心臟手術治療常見的并發癥。如何解決MIRI也成為當今研究的熱點問題。近年來有學者提出心肌能量代謝障礙是MIRI的始動因子［8］。心肌缺血后，脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化受阻，靠糖的無氧酵解來提供ATP，但是無氧糖酵解產生ATP的能力只有有氧氧化的1/18，造成心肌細胞內ATP的迅速耗竭。ATP水平的降低將導致心肌細胞代謝紊亂、功能低下，進而通過不同途徑引起組織結構和功能的損害［9，10］。例如，糖酵解的加速為心肌提供一定ATP的同時也使組織間液和細胞內的pH值明顯降低，再灌注后組織間液的H+濃度迅速下降，而細胞內的H+濃度仍然很高，這時，細胞膜兩側的H+濃度差可激活Na+/H+和Na+/Ca2+交換蛋白，促進Ca2+內流，加重細胞內鈣超載，造成線粒體等功能和結構方面的損傷，進而引起心肌的缺血/再灌注損傷［11］;另外，由于 ATP不能及時合成，心肌需要的能量將由ATP以ATP、ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤(IMP)的順序降解的方式來提供。這將會造成心肌 ATP、ADP、AMP及TAN含量的減少。

Tab 1 the effects of IDHP on the content of HEP in myocardium with ischemia/reperfusion in rats(±s，n=7)

Tab 1 the effects of IDHP on the content of HEP in myocardium with ischemia/reperfusion in rats(±s，n=7)

△△P ＜0.01 vs normal group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group ATP mg/100 g ADP mg/100 g AMP mg/100 g TAN mg/100 g Control 22.71 ±5.31 92.00 ±37.14 112.71 ±19.01227.43 ±36.43 Model 7.13 ±1.96△△ 5.24 ±1.72△△ 14.43 ±6.59△△ 27.90 ±7.53△△Pre-CDDP 50.00 mg·L－1 15.64 ±6.38* 48.41 ±16.31＊＊ 74.63 ±22.38＊＊ 138.69 ±42.72＊＊Post-CDDP 50.00 mg·L－1 12.90 ±5.91* 46.79 ±19.34＊＊ 71.53 ±36.23＊＊ 131.21 ±56.84＊＊Pre-IDHP 4.00 mg·L－1 12.30 ±6.27* 32.53 ±12.20＊＊ 73.53 ±34.41＊＊ 118.36 ±49.06＊＊Post-IDHP 4.00 mg·L－1 13.43 ±5.10* 49.07 ±30.68＊＊ 74.67 ±33.96＊＊ 137.17 ±63.21＊＊Pre-IDHP 0.04 mg·L－1 11.33 ±5.15 23.53 ±9.56* 35.11 ±11.72＊＊ 69.97 ±13.85＊＊Post-IDHP 0.04 mg·L－1 10.81 ±5.96 22.53 ±10.95＊＊ 40.27 ±23.85＊＊ 73.61 ±30.62＊＊

Fig 1 The ultrastructure of myocardium in the control group A:×5 000;B:×20 000 Fig 2 The ultrastructure of myocardium in the MIRI group A:×8 000;B:×20 000 Fig 3 The ultrastructure of myocardium in the Pre-CDDP(50.00 mg·L－1)group A:×7 000;B:×20 000 Fig 4 The ultrastructure of myocardium in the Post-CDDP(50.00 mg·L－1)group A:×6 000;B:×20 000 Fig 5 The ultrastructure of myocardium in the Pre-IDHP(4.00 mg·L－1)group A:×4 000;B:×20 000 Fig 6 The ultrastructure of myocardium in the Post-IDHP(4.00 mg·L－1)group A:×6 000;B:×20 000 Fig 7 The ultrastructure of myocardium in the Pre-IDHP(0.04 mg·L－1)group A:×5 000;B:×20 000 Fig 8 The ultrastructure of myocardium in the Post-IDHP(0.04 mg·L－1)A:×6 000;B:×20 000

線粒體是進行細胞呼吸和氧化磷酸化反應生成ATP的重要亞細胞單位［12］，是能量代謝的重要器官，它可直接利用葡萄糖、游離脂肪酸及酮體作為燃料，經氧化磷酸化產生ATP［13］，其結構和功能狀態直接決定ATP的生成。當線粒體結構、功能出現問題時，氧化磷酸化功能受損，ATP生成減少。因而心肌線粒體的損傷程度也能反映MIRI程度。

本研究結果顯示:空白對照組心肌ATP、ADP、AMP含量及TAN是各組中最高的，且心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，心肌細胞核膜完整，染色質均勻、細密，線粒體基質致密，嵴排列緊密，糖原顆粒豐富，表明其心肌無損傷，能量代謝正常;模型組的ATP、ADP、AMP及TAN含量與空白對照組相比顯著降低，且心肌細胞超微結構損傷最嚴重，心肌細胞有輕度少量壞死區肌節排列紊亂或消失，核的一端基質明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，線粒體和糖原數量明顯減少，表明缺血/再灌注損傷造成了心肌細胞線粒體結構破壞，影響了線粒體的正常功能，使其合成ATP能力下降，造成心肌能量代謝障礙。與模型組相比，各用藥組的ADP、AMP 及 TAN 升高，CDDP 50.0 mg·L－1前保護和后保護組、IDHP 4.00 mg·L－1前保護和后保護組的ATP含量亦升高;CDDP 50.00 mg·L－1前保護、后保護組及IDHP 4.00 mg·L－1前保護、后保護組超微結構與空白對照組相似，損傷較輕;IDHP 0.04 mg·L－1前保護、后保護組心肌細胞超微結構的損傷與模型組相比有所改善，但損傷仍較嚴重。

結果提示，IDHP能夠減輕心肌細胞線粒體結構損傷，改善心肌能量代謝，且這種作用隨劑量的增加而加強，這可能與其能夠擴張血管有關［14］，但其具體機制尚需進一步研究。

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