PRKAA2基因多態性與二甲雙胍療效的相關性研究

李建娥，蘭 怡，李琳琳，白旭東，毛新民，3

(1.新疆醫科大學藥理學教研室，新疆 烏魯木齊 830054;2.新疆烏魯木齊市友誼醫院干部病房，新疆 烏魯木齊 830049;3.新疆醫科大學第一附屬醫院糖尿病VIP實驗室，新疆烏魯木齊 830054)

近年來腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)已成為2型糖尿病(T2DM)領域的研究熱點，AMPK已經被看作是T2DM治療的潛在的藥理作用靶點［1－2］。二甲雙胍作為T2DM治療的一線藥物，在糖尿病治療的臨床實踐中表現出良好的降糖效果，并有改善胰島素敏感性、調節脂肪代謝等作用。大量實驗表明，二甲雙胍可通過部分途徑激活肌肉和肝臟中的AMPK，使其活化，調節葡萄糖和和脂質代謝，改善胰島素敏感性［3－6］。臨床試驗數據表明［7］，超過36%的糖尿病患者服用二甲雙胍后達不到預期的空腹血糖控制目標，即存在用藥個體差異性，由此我們假設這種用藥個體差異性可能與編碼AMPKα2亞基的基因PRKAA2的變異有關。本文旨在了解T2DM患者服用二甲雙胍的療效與PRKAA2基因多態性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 樣本來源 新疆烏魯木齊市友誼醫院、第二濟困醫院以及喀什東路社區衛生服務站周圍社區被診斷為T2DM的患者共32人，男性19人，女性13人，年齡42～71歲。依據2006年WHO T2DM診斷標準:空腹血糖≥7.0 mmol·L－1或餐后2 h血糖≥11.1 mmol·L－1。

1.1.2 納入標準 經確診為T2DM的且未服用任何降糖藥物的患者直接納入研究范圍，若已接受過T2DM藥物治療的患者，在經過5～7個藥物半衰期后可納入研究范圍。

1.1.3 排除標準 患有胃腸炎、潰瘍，腎功能不好的病人及偏瘦的病人;因腹瀉等副作用不能繼續服用二甲雙胍的病人;因其他原因中斷藥物干預的病人;干預過程中加入或改用其它藥物治療的病人。

1.1.4 藥物干預及血樣的采集 確診為T2DM的患者服用二甲雙胍干預1周，劑量為2 000 mg·d－1，服藥前、服藥1周后采血，分離血清，分別測定藥物干預前后的空腹血清血糖(fasting plasma glucose，FPG)、總膽固醇(total cholesterin，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterin，HDL-C)。

1.2 基因組DNA的提取EDTA-K2抗凝血約3 ml，常規酚/氯仿/異戊醇提取基因組DNA。

1.3 PCR引物及反應條件利用Primer 5.0設計SNP1rs2051040和SNP2rs17848595兩對引物，并用Winmelt軟件分析確定GC夾子的位置，GC夾子均加在兩對引物上游引物的5'端。

PCR 反應體系為25 μl，含雙蒸水9.5 μl，Master 12.5 μl，上下游引物各 0.5 μl(10 μmol·L－1)，DNA 模板 2.0 μl。反應條件 94℃ 5 min，94℃ 30 s，T 30 s，72℃ 1 min，35 個循環，72℃ 5 min，兩個片段T值分別是58℃，61℃。PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳、標準Marker和陰性對照鑒定。

1.4 DGGE檢測基因型檢測采用DCode通用突變檢測系統(Bio-Rad公司)。應用軟件Winmelt對待測DNA序列進行分析，根據解鏈溫度曲線確定電泳緩沖液溫度和變性劑梯度范圍。取7 μl PCR產物與7 μl上樣緩沖液混合，上樣于8%(35∶7)聚丙烯胺凝膠中，緩沖液溫度為60℃，變性劑濃度為15% ～30%、25% ～40%，150 V電壓，電泳4 h，EB染色。凝膠成像系統拍照。

1.5 統計學分析運用基因計數法計算各組基因型頻率及等位基因頻率，應用擬合優度χ2檢驗兩組基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡。計量資料用±s表示，配對t檢驗進行治療前后的比較。上述數據處理運用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 PCR-DGGE電泳結果本實驗采用酚氯仿法提取全血標本的基因組DNA，經紫外分光光度法測定，OD260nm/OD280nm均大于1.6，說明純度良好。利用聚合酶鏈反應，按本文前述的反應條件進行目的基因擴增。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠鑒定。PCR產物經過DGGE檢測基因突變，結果如Fig 1所示，每個樣本經過3次重復實驗，驗證實驗的準確性和重復性。

2.2 SNP基因型及等位基因頻率分布根據DGGE電泳條帶對SNP位點的基因型進行判斷，計算各基因型及等位基因的頻率，結果Tab 1、2所示。rs20510403種基因型CC、CT、TT頻率在有效組中分別為56.5%、30.5%、13.0%，在無效組中分別為33.3%、44.5%、22.2%。rs17848595 3種基因型AA、AG、GG頻率在有效組中分別為 52.2%、34.8%、13.0%，在無效組中分別為 55.6%、33.3%、11.1%，rs2051040基因型頻率在有效組與無效組兩組的差異有統計學意義(χ2=11.36，P=0.003)，rs17848595基因型頻率在有效組與無效組兩組的差異無統計學意義(χ2=0.37，P=0.829)。兩SNP位點等位基因頻率分布在有效組與無效組的差異無統計學意義。

Tab 1 Primer sequence

Fig 1 Parallel DGGE gel of PCR products

Tab 2-1 SNP rs2051040 genotype and allele frequency

Tab 2-2 SNP rs17848595 genotype and allele frequency

2.3 基因多態性與二甲雙胍療效的關系見Tab 3。T2DM患者經過二甲雙胍治療1周后，rs2051040 C/C基因型的患者FPG、TG、TC、LDL-C指標與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，C/T基因型的患者TG、TC、LDL-C指標與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，T/T基因型的患者TG、TC指標與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，各組HDLC在治療前后均沒有變化(P＞0.05)。rs17848595 A/A基因型的患者FPG、TG、TC、LDL-C指標與治療前比較差異均有顯著性(P＜0.05)，A/G基因型的患者TC、LDL-C指標與治療前比較均有差異(P＜0.05)，T/T基因型的患者上述指標的變化沒有影響(P＞0.05)，各組HDL-C在治療前后均沒有變化(P＞0.05)。

3 討論

AMPKα2亞基主要存在于骨骼肌和肝臟中。在骨骼肌中激活AMPK可增加葡萄糖的攝取和胰島素的敏感性［8］，而在肝臟中激活AMPK會抑制葡萄糖的產生［9］。AMPKα1-/-小鼠沒有表現出代謝缺陷，而AMPKα2－/－小鼠卻呈現出高血糖和胰島素抵抗［10］。一些實驗已證明α2催化亞基在降糖藥物二甲雙胍的刺激作用下被磷酸化［5，10－12］，進一步激活AMPK產生一系列生理學效應，說明α2催化亞基在AMPK活化過程中起關鍵作用。

α2亞基由 PRKAA2基因編碼，位于1p36-32上，是日本人T2DM圖譜位點之一，曾報道過這與日本人 T2DM 有關［13］。本研究選取 Horikoshi等［14］所做研究中提到的PRKAA2 rs2051040和第4外顯子區的rs17848595兩個SNP位點進行分型，旨在探討其是否與二甲雙胍用藥個體差異有關。

二甲雙胍干預1周后，據臨床經驗，FPG降低10%為治療有效，血糖下降未達到上述標準的認為治療無效。采用PCR-DGGE的方法對受試者的基因型頻率及等位基因頻率進行分析，rs2051040位點基因型頻率分布及基因型構成比在有效組與無效組之間有差異。攜帶野生型基因型患者的FPG、TG、TC、LDL-C指標與治療前比較差異有顯著性(P＜0.05)。rs17848595基因型構成比在有效組與無效組之間差異無統計學意義。但是從其與二甲雙胍療效關系表中可以看出，突變型等位基因可能是影響其療效的因素，出現兩種不同結果的原因可能是樣本例數偏少，在按照療效分組時計算的基因構成比可能與大樣本的基因型分布有一定差別，需要更多的樣本去驗證這個結論。本研究中，二甲雙胍調節血糖血脂的作用由于 α2亞基基因 PRKAA2的rs2051040和rs17848595位點突變而發生改變，可能是α2催化亞基的磷酸化作用受到影響，進而影響了AMPK的活化，使二甲雙胍對攜帶不同基因型患者表現出不同的療效。

Tab 3 The relation of PRKAA2 genetic polymorphism and metformin response(mmol·L －1)

AMPK已被認為是二甲雙胍治療T2DM的潛在藥理學靶點，PRKAA2基因rs2051040和rs17848595兩個位點SNP均可以影響二甲雙胍調節血糖、血脂的代謝水平，這也進一步驗證了AMPK是二甲雙胍的靶點。本研究的結果只能說明 rs2051040和rs17848595位點的SNP與二甲雙胍用藥個體差異有關，與其它多態性位點構建單倍型是否與二甲雙胍用藥個體差異相關還有待進一步篩查，以便為糖尿病治療學和藥物基因組學研究提供更多的線索。

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