脊髓腺苷受體介導(dǎo)側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理對大鼠缺血后心肌的保護(hù)作用

梅 斌，張 野，陸 姚，程新琦，左友梅，李 銳，高 杉，陳志武

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230601;2.第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230022;3.藥理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射嗎啡可以減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷，且多種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)了這一作用［1-2］。大量研究證實［3］心肌腺苷受體和阿片受體的激動都可以有效地減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，并且二者存在著協(xié)同作用。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)［4］側(cè)腦室注射嗎啡可以促進(jìn)脊髓水平的腺苷釋放，但是存在于脊髓背角神經(jīng)元的腺苷受體在中樞嗎啡預(yù)處理所產(chǎn)生的心肌保護(hù)效應(yīng)中的作用尚不清楚。因此本研究的主要目的是探討脊髓腺苷受體是否介導(dǎo)了側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，以及這一介導(dǎo)作用與心肌缺血/再灌注損傷所引起的炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物模型

1.1.1 鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)置管動物模型的建立［5-6］選擇250～300 g♂SD大鼠，5%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1，ip。參照文獻(xiàn)方法，頸部沿脊柱切開皮膚2 cm，分離組織肌肉，暴露寰枕膜，向尾端將PE-10導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔約4 cm，固定導(dǎo)管，縫合傷口。鞘內(nèi)置管完成后，將大鼠固定在腦立體定位儀(藍(lán)星B型，淮北振華生物科技有限公司)上，暴露顱骨，根據(jù)Paxinos-Watson圖譜定位側(cè)腦室置管位置(坐標(biāo):P 1.5 mm，R 1.5 mm，H 3.0 mm)，用大鼠顱骨鉆鉆孔，將內(nèi)徑0.36 mm、外徑0.71 mm導(dǎo)管插入側(cè)腦室，腦脊液流出后，插入內(nèi)芯，用502膠混合牙托粉固定在顱骨上，以備側(cè)腦室給藥用，術(shù)后肌注青霉素10萬U，手術(shù)后動物均分籠單獨飼養(yǎng)3 d以備實驗。有感覺或運動障礙大鼠棄去。

1.1.2 心臟缺血/再灌注損傷模型的建立［1-2］所有成功鞘內(nèi)和側(cè)腦室置管的大鼠，5%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1，ip。麻醉后氣管切開、插管后連接動物呼吸機(jī)(HX-300型成都泰盟生物科技有限公司)行機(jī)械通氣，潮氣量2～4 ml·kg-1，頻率70～80次。右股動脈切開置管，接壓力換能器，連接Power-Lab Systems(AD公司，澳大利亞)，記錄心電圖(ECG)、血壓(BP)﹑平均動脈壓(MAP)和心率(HR);右股靜脈切開置管用于輸液。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在左4～5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)心腔，擠出心臟。在動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈，方法是用6-0 Prolene線作一線結(jié)，把心臟放回胸腔。穩(wěn)定15 min后，收緊線結(jié)即形成左冠狀動脈閉塞致心肌缺血，表現(xiàn)為局部心肌發(fā)紺﹑血壓下降，ECG呈心肌梗死改變(ST段抬高或降低等);松開線結(jié)即可實現(xiàn)再灌注。平均動脈壓低于30 mmHg或出現(xiàn)頑固性室性心律失常的大鼠棄去不用。實驗結(jié)束后，暴露大鼠脊髓，并且側(cè)腦室內(nèi)注射亞甲藍(lán)1 μl，確定鞘內(nèi)和側(cè)腦室置管的準(zhǔn)確性和有無損傷。

1.2 藥品和試劑嗎啡(批號090602-2，沈陽第一制藥廠)，茶堿(批號118K0890，Sigma公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，使用濃度為100 mmol·L-1，磷酸鹽緩沖液 pH 7.4，溶解)，兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體(北京博奧森公司)，S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 實驗方法成功建立動物模型的54只♂SD大鼠，隨機(jī)5組，除茶堿自身對照組(6只)外，其他每組12只。①假手術(shù)組(Sham組)，大鼠開胸后左冠狀動脈僅穿線不結(jié)扎，也不給與任何處理;②對照組(CON組):缺血30 min/再灌注120 min前，側(cè)腦室內(nèi)微量泵(史密斯公司，英國)恒速注射0.9%生理鹽水5 μl 5 min，停止注射5 min，重復(fù)3次，共計15 μl;③ 嗎啡預(yù)處理組(MPC組):在缺血30 min/再灌注120 min前，側(cè)腦室內(nèi)微量泵恒速注射嗎啡(1 μg·kg-1，用生理鹽水稀釋到 5 μl)5 min，停止5 min，重復(fù)3次，共計15 μl。④ 腺苷受體阻斷劑茶堿+嗎啡預(yù)處理組(MPC+THE組):在側(cè)腦室注射嗎啡前15 min一次性鞘內(nèi)注射茶堿10 μl(質(zhì)量濃度為5×103mg·L-1);⑤茶堿自身對照組(THE組):在側(cè)腦室注射0.9%生理鹽水前15 min一次性鞘內(nèi)注射茶堿10 μl(質(zhì)量濃度為5×103mg·L-1)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血流動力學(xué)指標(biāo)測定 通過PowerLab Systems連續(xù)記錄心電圖(ECG)、動脈血壓(BP)和心率(HR)。比較各組手術(shù)穩(wěn)定后15 min(基礎(chǔ)值)、缺血前、缺血30 min后和再灌注120 min后平均動脈壓(MBP)和心率(HR)，計算平均動脈壓和心率乘積(RPP)。

1.4.2 心肌梗死面積測定 在再灌注120 min時，取出心臟，剔除非心臟組織。生理鹽水灌注，沖洗出血液，結(jié)扎左冠狀動脈，從主動脈注入0.25%Evan blue dye溶液。置-80℃冰箱備用。將速凍后的心臟從心尖到心基部平行切5～6片，2 mm厚的心肌片，置1%氯化三苯基四氮唑 (TTC)溶液中，在37℃(pH 7.4)溫孵 15 min，染色，后置 10%福爾馬林固定，缺血危險區(qū)為紅色，梗死區(qū)為白色，在圖像分析軟件(Sigma Scan Program 4)下計算出左、右心室(LV，RV)、缺血危險區(qū)(AAR)和梗死區(qū)(IS)的面積，用面積乘以2 mm即為各自的體積，心肌梗死區(qū)面積以IS/AAR來表示。

1.4.3 免疫組化測定心肌ICAM-1 在再灌注120 min時，快速取出心臟，從心尖部剪下一塊心肌組織，放入10%福爾馬林中浸泡。常規(guī)包埋心肌標(biāo)本，用切片機(jī)連續(xù)切成4 μm厚的冠狀切片、脫臘，ICAM-1一抗按1∶150稀釋，并按S-P法進(jìn)行免疫組化染色，同時設(shè)陰性對照(用PBS替代一抗)，在倒置相顯微鏡(Olympus，Japan，×400)下拍取圖像。用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析測定平均光密度(average optical density，AOD)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls分析。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)Sham組的 HR、MAP和RPP在各時點比較均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與CON組比較(Sham組除外)，各組HR、MAP和RPP在基礎(chǔ)值，缺血前，缺血30 min和再灌注120 min時比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。但與同組基礎(chǔ)值比較，各組HR、MAP和RPP在缺血30 min和再灌注120 min時都有降低(P＜0.05)。Tab 1。

2.2 心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo)各組LV+RV和AAR體積差異無顯著性(P＞0.05)。在IS和IS/AAR方面，MPC組與CON組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明側(cè)腦室注射嗎啡預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。MPC+THE組與MPC組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，同時，MPC+THE組與CON組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明鞘內(nèi)注射茶堿部分阻斷了側(cè)腦室注射嗎啡預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。THE自身對照組與CON組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明鞘內(nèi)注射茶堿對IS以及IS/AAR沒有影響，Tab 2。

Tab 1 Hemodynamic parameters(±s，n=6)

Tab 1 Hemodynamic parameters(±s，n=6)

HR:heart rate(bpm);MAP:mean arterial pressure(mmHg);RPP:rate pressure product(mmHg·min-1/1 000)

Group Baseline Treatment 30-min occlusion 2-hour reperfusion HR MAP RPP SHAM 396±22 98±9 39±6 381±17 106±15 38±4 377±2 HR MAP RPP HR MAP RPP HR MAP RPP 5 77±10 34±8 384±16 80±13 37±6 CON 399±29 106±8 37±4 394±21 110±11 35±6 352±26 84±4 28±3 325±17 96±10 30±4 MPC 439±13 99±12 43±6 376±16 97±9 39±5 343±15 69±9 25±4 317±19 85±13 26±7 MPC+THE 413±26 112±9 41±3 380±15 99±16 35±7 346±13 82±3 26±1 326±20 88±5 27±3 THE 406±20 108±15 40±4 384±11 107±17 37±5 344±2 83±6 27±3 323±20 85±7 24±3

Tab 2 The changes of morphometrics( ± s，n=6)

Tab 2 The changes of morphometrics( ± s，n=6)

LV:left ventricle volume;RV:right ventricle volume;IS:infarct size;AAR:area at risk ＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs MPC

Group LV+RV volume/cm3 IS/AAR/%CON 0.92 ±0.11 0.44 ±0.02 0.22 ±0.02 51.2 ±3.3 ARR volume/cm3 IS volume/cm3 MPC 0.92 ±0.08 0.47 ±0.04 0.13 ±0.01＊＊ 28.1 ±2.5＊＊MPC+THE 0.91 ±0.04 0.45 ±0.04 0.19 ±0.01＊＊##44.0 ±2.0＊＊##THE 0.92 ±0.09 0.44 ±0.04 0.23 ±0.02 52.8 ±3.0

2.3 心肌組織的ICAM-1表達(dá)水平與Sham組相比，CON組心肌中的ICAM-1的表達(dá)明顯增多(P＜0.01);相對CON組而言，MPC組心肌中的ICAM-1的表達(dá)明顯減少(P＜0.01);而THE+MPC組心肌中的ICAM-1的表達(dá)水平較MPC組而言，明顯增多(P ＜0.01)，卻明顯低于 CON 組(P ＜0.01)，F(xiàn)ig 1，2。

Fig 1 Expression of ICAM-1 in the myocardial(×400)

Fig 2 The average optical density(AOD)of ICAM-1 in myocardial( ± s，n=6)

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射小劑量嗎啡可以減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷的梗死區(qū)面積，與痛覺相關(guān)的物質(zhì)在其中起到關(guān)鍵作用，如P物質(zhì)(substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、β-內(nèi)啡肽等［1，7］。

早在1989年DeLander等［8］就提出脊髓的腺苷及其受體參與了側(cè)腦室注射嗎啡的外周鎮(zhèn)痛作用。Sweeney等［4］通過測定脊髓腺苷水平以及鞘內(nèi)注射茶堿發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射嗎啡可以促進(jìn)大鼠脊髓水平腺苷的釋放，從而活化存在于脊髓背角的腺苷受體，產(chǎn)生外周的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。本研究同樣通過在側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理前鞘內(nèi)注射茶堿，發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理的心肌保護(hù)作用被明顯削弱，而僅僅鞘內(nèi)注射茶堿而不進(jìn)行側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理與對照組相比對心肌梗死面積沒有影響，這說明存在脊髓的腺苷受體不但介導(dǎo)了側(cè)腦室注射嗎啡的外周鎮(zhèn)痛作用，還參與了側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理的心肌保護(hù)作用，而鞘內(nèi)注射茶堿本身對心肌缺血/再灌注損傷并沒有任何作用。

痛覺的產(chǎn)生是炎癥反應(yīng)的重要體現(xiàn)，而在心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)的病理生理學(xué)過程中，中性粒細(xì)胞黏附一直被認(rèn)為是加重?fù)p傷的重要因素［9］。本研究所測定的ICAM-1是反映中性粒細(xì)胞粘附的良好指標(biāo)［10］。Bong 等［11］發(fā)現(xiàn)脊髓腺苷 A1受體的激動可以抑制脊髓的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，通過上調(diào)外周炎癥反應(yīng)部位的腺苷水平減輕炎癥反應(yīng)。但也有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角的各種腺苷受體亞型的激動都可以減輕外周炎癥反應(yīng)所致的痛覺過敏，只是產(chǎn)生作用的時相不同［12］。為了闡明脊髓腺苷受體介導(dǎo)側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理的心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制，我們通過測定大鼠心肌ICAM-1水平發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理可以明顯的減輕心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，而事先鞘內(nèi)注射腺苷受體阻斷劑卻明顯減輕這一作用，說明脊髓腺苷受體的介導(dǎo)作用可能是通過減輕心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的。不足的是，我們沒有對腺苷受體的各個亞型進(jìn)行深入的探討，在以后的工作中我們將繼續(xù)進(jìn)行這方面的研究。

在本次研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理之前鞘內(nèi)注射腺苷受體阻斷劑并不能完全消除側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理所發(fā)揮的心肌保護(hù)作用。相關(guān)的中樞嗎啡和腺苷對內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用的研究可以間接地解釋這一現(xiàn)象:鞘內(nèi)注射腺苷類似物可以減少腦脊液中SP的水平，但是CGRP的水平?jīng)]有改變，而脊髓中內(nèi)源性的阿片物質(zhì)不光調(diào)節(jié)了SP的水平，CGRP的水平也發(fā)生了變化［13-14］。我們已經(jīng)證實CGRP水平與心肌缺血/再灌注損傷呈負(fù)相關(guān)［1］。

綜上所述，側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理可能通過促進(jìn)脊髓腺苷的釋放而上調(diào)大鼠脊髓腺苷受體的激動水平，后者通過抑制心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應(yīng)部分介導(dǎo)了側(cè)腦室嗎啡預(yù)處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。

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