我國細菌內毒素檢查法的應用進展

周筱莉

（廣西壯族自治區桂林食品藥品檢驗所，廣西桂林 541002）

藥品注射劑的熱原檢查是保證藥品安全的重要檢驗項目。半個多世紀以來，采用家兔法（PT法）檢查熱原曾對保證藥品的安全發揮了重要的作用，但是家兔法耗時長，不經濟，且有很多局限性。細菌內毒素檢查法（BET法）因其簡便、靈敏、快速、準確等優點，已被廣泛用于檢查藥品注射劑及其原料藥和臨床醫療器具中的致熱物質，并逐步替代傳統的PT法檢查熱原。我國學者從20世紀70年代初期就開始對BET法進行了研究。近年來，我國廣大的醫藥學工作者為擴大BET法的應用，對注射用原料藥及其注射制劑和輸液制劑生產過程、臨床醫學的應用及所涉及的設備器具可能引入的熱原進行了廣泛的應用研究。筆者通過檢索查閱近5年以來醫學和藥學方面公開報道的文獻資料，對我國近年來對BET法的應用研究進展作一綜述。

1 BET法在藥用原料及注射制劑檢查的研究

1.1 化學藥品

《中國藥典》2005年版二部（化學藥品）需用BET法檢查熱原的藥品有73個品種的原料藥及其注射制劑共205個。此外，有文獻報道認為能用于BET法檢查化學原料藥及注射制劑中的熱原有卡鉑原料藥、5種氨基酸原料藥、三磷酸腺苷二鈉注射液、注射用脫氧核糖核酸等四十余種。

藥廠在制備注射制劑過程中，藥品從原料到成品的多道工序都要進行熱原監測?？ㄣK是一抗腫瘤原料藥，標準未要求做熱原檢查及細菌內毒素檢查，其注射制劑規定做家兔熱原檢查。研究認為卡鉑原料藥用BET水稀釋到5 mg/ml的濃度，用凝膠限量法試驗無干擾，可建立卡鉑BET法[1]。

楊善彬等[2-3]對注射用L-纈氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸4種氨基酸原料藥BET法可行性進行了研究，并對現行標準進行方法學驗證。 在16倍稀釋級下，L-纈氨酸（C=2.5%）對鱟試劑（TAL）無干擾，用靈敏度為0.5 EU/ml的TAL檢查其內毒素方法可行，其細菌內毒素含量＜0.04EU/ml，顯著高于《中國藥典》2005年版二部的規定（5 EU/ml）。認為L-纈氨酸和L-異亮氨酸在2～16倍的稀釋級下（C=2.5%）時對TAL無干擾，檢測細菌內毒素的TAL靈敏度≤0.04 EU/ml，而在16倍的稀釋級范圍內，L-脯氨酸（C=4.5%）和L-亮氨酸（C=2%）對TAL有抑制作用。

硫酸阿托品注射液為臨床常用非選擇性M膽堿受體阻斷劑，是《中國藥典》2005年版收載的品種，原質量標準中無熱原檢查項目。高錦等[4]認為用靈敏度分別為0.25 EU/ml和0.125 EU/ml的TAL檢測其稀釋液0.25 g/ml及更低濃度時，無干擾因素影響。將硫酸阿托品注射液細菌內毒素限值（L）確定為50 EU/ml，可用于BET法檢查。

鹽酸丁卡因注射液是局部麻醉藥。丘樹勝等[5]利用丁卡因的脂溶性將其萃取后進行細菌內毒素檢查，實驗結果顯示20批鹽酸丁卡因注射液中細菌內毒素均低于0.5 EU/ml。認為用萃取法制備供試液試驗，可真實地反應該藥品中細菌內毒素的污染程度。

亞甲藍注射液在臨床上主要用于氰化物、硝酸和亞硝酸鹽中毒的解救，其細菌內毒素的含量是影響該藥品質量的重要指標。肖貴南等[6-7]采用動態比濁法對亞甲藍注射液和低分子量肝素鈣注射液進行定量檢測，并與凝膠法結果比較，亞甲藍注射液在濃度為0.125 mg/ml時對試驗無干擾，所測樣品（10 mg/ml）的細菌內毒素均＜0.25 EU/ml；低分子量肝素鈣注射液稀釋至12.5 IU/ml對試驗無干擾作用，檢查樣品中細菌內毒素的含量均＜0.01 IU/ml，與凝膠法結果基本一致，認為這2個品種可建立BET法。

抗凝劑溶液常用于臨床血液的保養，藥品標準要求作細菌內毒素檢查。該品種主要成分枸櫞酸及枸櫞酸鈉會對細菌內毒素產生嚴重干擾。熊向黨[8]提出用含有氫氧化鈣的稀釋劑稀釋樣品11倍可以消除對細菌內毒素的干擾作用；柏玉碧等[9]認為將樣品用檢查用水稀釋40倍用于試驗可排除干擾因素。

1.2 中藥注射劑

《中國藥典》2005年版一部尚未收載中藥注射劑。在現行國家藥品標準（新藥轉正標準）2008年版中，有4個化學藥注射劑（含有中藥成分）規定用BET法代替PT法。有文獻認為，可建立BET法的中藥注射劑有金葉敗毒注射液、舒血寧注射液、燈盞花素注射液等近20個品種。張德波等[10]在現行國家標準的基礎上對紫杉醇注射液BET法進行了再研究，確定合理的紫杉醇注射液內毒素L及最大不干擾試驗濃度。結果證明使用現行國家標準所確定的內毒素L為0.4 EU/ml不變，三批紫杉醇注射液的干擾試驗0.075 mg/ml（對應使用靈敏度為0.4 EU/ml）符合要求。倪立堅[11]用半定量法估算生脈注射液細菌內毒素的含量，認為該藥品可建立BET法。

1.3 生物制品

《中國藥典》2005年版第三部（生物制品）有46個品種用于注射給藥，其中有16個制劑需用BET法檢查熱原。白春杰等[12]研究BET法與PT法檢測破傷風抗毒素細菌內毒素結果的相關性，按照標準操作建立其檢測方法，供試品在最大有效稀釋倍數下試驗無干擾。細菌內毒素檢測結果與熱原檢查結果對比，檢測10批破傷風抗毒素細菌內毒素限量符合規定，與PT法對比完全相同。應蓮芳等[13]將重組人型肝炎疫苗供試品用PT法及BET法進行試驗，溶液濃度在40μg/ml，確定L為40 EU/ml，對試驗無干擾。該疫苗用BET法可代替PT法。李紅芳等[14]對乙型腦炎減毒活疫苗用凝膠限量法，將供試品稀釋160倍，L定為40 EU/ml進行試驗結果對實驗無干擾。認為可用于乙型腦炎減毒疫苗中間產品的細菌內毒素檢查。

2 BET法在制藥生產工藝中的研究

在注射劑制藥生產流程中及所用試驗器材常常受到熱原污染，250℃干熱60 min是除去熱原的常用方法。為了確認隧道式烘箱和干熱恒溫箱腔內不同位置的熱分布情況，除熱原程序能否達到預先設計要求。湛江海洋生物有限公司對隧道烘箱及干熱烤箱去除內毒素效果進行了驗證試驗：用開啟的內毒素指示劑固定于烤箱的冷點位置，設備按實際生產運行條件下操作，操作完畢取出內毒素指示劑，放置常溫后制備成供試品溶液進行細菌內毒素檢查，供試品溶液的結果用于判斷隧道烘箱及干熱烤箱干熱滅菌除熱原的有效性。

3 BET法在臨床應用中的研究

3.1 輸液器具及外科手術器材

BET法已廣泛應用于臨床一次性使用輸液輸血器具及外科手術器材等的檢查。臨床輸液的全過程包括：大輸液、輸液管、配液注射器及輸液中的其他藥物。在給患者輸液治療中，如不嚴格操作，每個環節都有可能污染熱原。劉守信等[15]就一般性感冒藥物，生理鹽水+青霉素+病毒唑為例，用細菌內毒素毒素定量儀對臨床輸液全過程進行質量監控的研究。祝清芬等[16]對眼部用藥透明質酸鈉眼內植入物的細菌內毒素檢查進行了研究，將供試品的浸提液制成1 mg/ml試驗對TAL無干擾。認為本品可建立BET法。

3.2 醫用生物材料

熱原檢查是評價醫用生物材料安全性重要指標之一。張逸等[17]采用PT法和BET法對粘克TM吸收醫用膜72 h的浸提液樣品進行對比檢測，該浸提液原液用細菌內毒素檢測不產生干擾，細菌內毒素試驗結果為陰性，與家兔試驗相符，符合醫用生物材料的使用標準。認為可用BET法代替PT法。

3.3 臨床中的輔助診斷

BET法在臨床應用中作為輔助診斷，檢查患者的血液、腦脊液等由革蘭陰性菌產生的內毒素含量。透析法是尿毒癥患者賴以生存的腎臟替代治療，但透析液中內毒素有可能通過正常的透析膜進入血液的風險。高水平的內毒素可致熱原反應、彌漫性血管內凝血、內毒素血癥與休克等以至死亡，尤其對需要長期接受透析治療的患者更容易出現。勞海燕等[18]用同體系模型動態比濁法定量測定血液透析濃縮液的細菌內毒素進行了研究，試驗中定量添加標準內毒素，從中篩選出最佳的稀釋倍數為40倍進行試驗無干擾作用。認為此方法可以定量檢測透析液中的細菌內毒素，從而保證臨床用藥的科學性和安全性。

4 BET 法的方法學研究

4.1 動態濁度法

熊向黨[19]使用不同檢測波長作動態濁度法細菌內毒素檢查的比較。在405～660 nm波長處用動態儀對小牛血清及水解蛋白物注射液樣品作動態比較內毒素檢測。2種樣品在不同波長動態儀測量內毒素含量RSD＜10%，所得結果與動態濁度法細菌內毒素檢查一致。

4.2 特異性TAL

試驗在最大有效稀釋倍數下或用其他方法不能排除干擾的時候，如果選用特異性TAL試驗，則為消除干擾提供了另一條途徑。實驗證實不含發熱物質的葡聚糖能引起鱟試驗呈陽性反應[20]。在用普通TAL和特異性TAL分別與不同濃度和相同濃度的含糖大輸液進行凝膠試驗時，含糖大輸液比普通TAL凝膠試驗陽性率高，而且糖濃度越高、裝量越大，陽性反應率越高，且受取樣位置的影響。

4.3 細菌內毒素快速檢測試劑盒

熊向黨[19]報道，通過制備細菌內毒素快速檢測試劑盒，能使凝膠法的細菌內毒素檢查的反應時間由常規法的60 min縮短至幾分鐘甚至更短。

4.4 顯色基質TAL（終點法）

丁友玲等[21]采用顯色基質TAL（終點法）測定BET水及有色藥品中微量細菌內毒素。經檢測多次高壓滅菌的BET水中微量細菌內毒素、并進行了血卟啉注射液細菌內毒素回收試驗。結果顯示最低檢測濃度可達0.001 5 EU/ml，細菌內毒素回收率分別為115.75%和115.00%。認為用顯色基質TAL定量測定有色藥品細菌內毒素含量可行。

4.5 凝膠法與光度測定法的比較

細菌內毒素檢查法包括2種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。定量法（動態濁度法）與凝膠法相比，定量法的分析技術可最大限度地消除內毒素標準品對試驗結果的影響。對一些組分復雜，干擾因素多的中藥、生化藥和生物制品注射劑可以選用定量法試驗，如三磷酸腺苷二鈉注射液[22]稀釋50～400倍，金葉敗毒注射液[23]稀釋100倍，采用動態比濁法試驗，極微量的內毒素都能檢出，同時能有效地消除對TAL的干擾。

5 結語

細菌內毒素檢查在藥品檢驗、制藥工藝及臨床醫學應用方面是一項重要的質控技術，許多國家的藥典收載了這一方法，家兔檢查熱原的方法因其難以標準化而使越來越多品種的熱原檢查項被BET法所取代，原對熱原檢查未作要求的品種也逐步建立起細菌內毒素的檢查方法。在對藥品的檢驗方面，美國藥典第25版已有627個藥品品種規定用BET法檢查熱原，而我國用于制備注射制劑的原料藥和相當多的注射用制劑沒有建立BET法。如注射用琥珀氯霉素無菌粉末及其原料藥，有些2種作用相似的藥品如注射用硫酸長春新堿規定做細菌內毒素檢查，而注射用硫酸長春堿卻未要求?！吨袊幍洹?005年版二部（化學藥品）在8種維生素類注射液中，只有維生素C注射液規定做細菌內毒素檢查，而在臨床用藥中，常常會將供肌內注射的藥品加入到輸液中進行靜脈給藥。筆者認為，在擴大藥品品種的應用研究方面，我國的藥學工作者還有大量的工作要做。

目前，在我國對細菌內毒素檢查的應用研究多數采用凝膠限量法試驗。細菌內毒素定量法技術可為供試品提供更大倍數的稀釋，極微量的細菌內毒素都能檢出，能更好地消除在實驗中帶來的干擾。在國外，細菌內毒素定量法的使用率已達65%～70%[24]，超過凝膠法，表明我國細菌內毒素定量技術與國際間差距較大。因此，我們應重視細菌內毒素定量技術的應用與研究。

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