白菜類蔬菜作物離體再生研究進展

樊明琴 朱月林 朱茂英 許樹成 李焰焰

（1阜陽師范學院生命科學學院，安徽 阜陽 236041；2南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095）

白菜類蔬菜屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）蕓薹種（B.campestris L.）中的栽培亞種群，是我國重要的蔬菜作物。目前，為進一步提高白菜類蔬菜的品質、抗病蟲性和抗逆性等，采用基因工程技術將目的基因導入白菜類蔬菜，在保持其原有優良性狀的基礎上改良白菜類蔬菜的遺傳特性，為白菜類蔬菜遺傳育種提供了新技術。但是基因工程技術的應用要求高效的不定芽再生體系，而白菜類蔬菜屬于蕓薹屬離體不定芽再生困難型植物（Lim et al.，1998），這是對其進行遺傳轉化的主要障礙（張松 等，1997）。隨著人們對離體條件下誘導白菜類蔬菜外植體再生植株的機理及影響因素等研究的不斷深入，目前，國內外不少學者已有利用白菜類蔬菜的腋芽、子葉、下胚軸、真葉、小孢子以及原生質體等（李曙軒和裘文達，1983；申書興 等，1999；侯喜林 等，2000；成細華 等，2001；Kang et al.，2002；邢德峰 等，2003）獲得再生植株的報道。白菜類蔬菜再生體系的建立已經取得快速發展，現將有關研究進展綜述如下。

1 植物材料基因型

植物材料的基因型對離體培養的效果有重要影響，不同栽培種之間植株再生能力不同。Dietert等（1982）認為基因型是限制白菜類蔬菜再生的一個重要因素。Murata和Orton（1987）研究指出，調控芽形成的基因可能位于C基因組，白菜類蔬菜（AA基因組）由于缺少C基因組而難于再生。Hachey等（1991）研究發現同屬于Canola型的5個栽培種在同一培養基上的再生頻率相差不大，均大于40%，但非Canola型的R-500的再生頻率不到10%。曹家樹等（2000）以杭州油冬兒等7個白菜類栽培種和1個雜交親本為試材，研究發現青梗類品種的植株再生頻率明顯高于白梗類品種。張鳳蘭等（2002a）對從中國和日本搜集到的123個大白菜品種和20個普通白菜（小白菜）品種進行子葉培養，123個大白菜品種中有8個品種無不定芽再生，其余 115個品種再生頻率為2.5 %～95.0%不等；20個普通白菜品種中有5個品種無不定芽再生，其余15個品種不定芽再生頻率為6.7 %～97.5 %。張松等（2002）以36個不同生態型的大白菜品種為試材，研究了基因型對芽分化的影響，再生頻率為0～86.67 %。不同品種之間，芽再生頻率差異較大，這與以往文獻報道的基因型對植株再生頻率有很大影響的觀點相一致（Jain et al.，1988；李世軍 等，1994）。因此，在試驗中應盡量選擇植株再生頻率較高的基因型材料。

2 植物外植體

2.1 外植體類型

外植體各部分的再生能力有很大差異，因此外植體的選用是影響白菜類蔬菜離體培養再生頻率的因素之一。白菜類蔬菜用于轉化的外植體較常用的為下胚軸、帶柄子葉、子葉等（蔡小寧 等，1995；余小林 等，2001；張鳳蘭 等，2002b；高紅亮 等，2008）。由于具有取材不受季節限制、誘導再生快、轉化突變率低等優點，利用這些外植體獲得了多個成功的轉化。王凌健等（1999）用普通白菜的子葉和下胚軸作外植體誘導分化，子葉的分化頻率可達56.3 %，下胚軸為37.0%。其中廣泛采用的是無菌種子苗的帶柄子葉（于占東 等，2005）。杜虹等（2000）在大白菜離體培養中發現子葉外植體誘導大白菜芽再生比下胚軸好，而帶有子葉柄的外植體比不帶子葉柄的分化頻率高，很可能是由于這一部分外植體包含分化能力較強的原分生細胞和子葉塊營養（曹家樹等，2000）。

2.2 外植體的生理狀態

外植體的生理狀態對白菜類蔬菜離體再生及轉化頻率也有很大影響。不同生長期的無菌苗明顯影響外植體不定芽再生能力。一般情況下，幼嫩組織比老化組織具有較高的形態發生能力。如普通白菜，3～4 d苗齡的無菌苗，其子葉和下胚軸作外植體，不定芽、苗的再生能力遠大于其他苗齡。Zhang等（1998）、張智奇等（1998）、曹家樹等（2000）都以4 d苗齡的普通白菜外植體作為試驗對象。謝建坤等（2000）認為5～9 d苗齡的外植體可以獲得較高的不定芽再生頻率，但對于不同基因型、不同的外植體來說，其最佳苗齡也有不同，杭州油冬兒普通白菜以7 d苗齡的子葉對不定芽的誘導效果最佳；高華普通白菜為7 d；香港菜薹為9 d。其機理可能是苗齡短的外植體切面薄壁細胞具有較高的再生能力，而苗齡較長的外植體，其切面細胞已開始分化，細胞分裂能力逐漸降低，故不定芽再生頻率低。由此看來，不同品種，不同外植體類型具有不同的最適取材時間。

2.3 外植體接種方式

張松等（2001）發現接種方式對大白菜子葉不定芽再生起著重要作用。朱麗華等（2006）以大白菜的下胚軸為材料，研究了3種不同接種方式對不定芽發生的影響，結果表明，與反插和平放的外植體相比，形態學下端插入培養基的正插方式明顯有利于不定芽的再生。接種方式的不同使外植體所處環境不同，可能是插植較平放更能使子葉柄切口端充分接觸培養基，吸收外源激素，同時亦能吸收子葉內源激素，有利于芽的再生。

3 培養基及其添加物

3.1 培養基

白菜類蔬菜離體培養中普遍用MS為基本培養基。王凌健等（1999）研究發現，降低培養基中濃度有利于減少普通白菜外植體分化過程中愈傷組織的形成。侯喜林和曹壽椿（1994）報道MS培養基中鹽濃度降低至原來的1/2倍，蘇州青普通白菜外植體的分化率由31.1 %提高到36.7 %。

3.2 瓊脂

劉凡等（1997）在大白菜小孢子胚培養中把培養基瓊脂含量由0.8 %提高到1.2 %，可以明顯促進胚的正常發育，減少畸形玻璃苗和二次分化成苗數量，大大提高成苗率。Zhang等（1998）用不同瓊脂濃度的培養基處理大白菜外植體，發現瓊脂濃度為1.2 %或1.6 %的培養基比濃度為0.8 %的培養基不定芽再生頻率高2～3倍。這可能是高濃度的瓊脂含量改變培養基中水分的存在狀態，同時培養基中濕度下降，改變了離體再生的小氣候從而使再生頻率提高。

3.3 植物激素組成

在白菜類蔬菜離體再生培養中，影響外植體再生頻率的主要因素是外源激素的含量（張鳳蘭等，2002a）。目前在建立白菜類蔬菜不定芽再生體系的報道中，6-BA與NAA的組合最多。高紅亮等（2008）在普通白菜兩個品種的帶柄子葉離體培養中用6-BA 4 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，不定芽再生頻率為81.7 %。很多試驗中發現，BA和NAA結合使用優于單獨使用的效果。張鵬和凌定厚（1995）在進行菜薹離體植株再生頻率研究時發現，培養基中分別使用BA和NAA時，植株再生頻率分別為7.8 %和5.5 %，兩者同時使用再生頻率提高4倍，與前人在蕓薹屬其他作物的外植體誘導芽器官發生取得的結果類似（Bhalla & Smith，1998）。

近年來有些報道苯基脲型的細胞分裂素TDZ等對誘導不定芽或胚狀體的形成比BA有更好的效果（馬光 等，2008；李玉玲 等，2008）。盧永恩等（2003）以兩種大白菜子葉為外植體，發現TDZ具有比BA更高的細胞分裂素活性，0.25 mg·L-1TDZ+0.5 mg·L-1NAA組合促進作用比2 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA組合還要好，且子葉再生頻率高、出芽迅速、芽點多。朱月林和李式軍（2001）報道在2個日本普通白菜品種中的子葉不定芽再生頻率最高，為96.7 %。樊明琴等（2005）對結球大白菜的子葉離體培養時發現，TDZ的不定芽分化率為75 %，6-BA的分化率僅為58.3 %。但是TDZ的濃度不是越高越好，高濃度的TDZ有一定的毒害作用，導致愈傷組織褐化，誘導的不定芽多呈叢生狀，不易分離，且芽成苗較困難，出現矮化、葉片卷曲、玻璃化等現象。高濃度BA也不利于植株再生。這表明，特定基因型的特定外植體對不同的細胞分裂素的要求都有一定濃度范圍，濃度過高和過低都影響其再生。另外，細胞分裂素必須與一定濃度的生長素配合，生長素濃度過高和過低均不利于植株再生。

3.4 AgNO3

在遺傳轉化過程中，篩選培養基中加入AgNO3作為乙烯抑制劑促進AA基因組作物再生的報道較多（Chi & Pua，1989；張鵬和凌定厚，1995；張松 等，1997；Zhang et al.，1998；吳昌銀 等，1999；曹家樹 等，2000）。據Zhang等（1998）報道，大白菜離體培養中添加適量的AgNO3能有效促進不定芽的發生，并提高正常不定芽的比率。杜虹等（2000）研究表明，大白菜離體不定芽再生頻率從無添加AgNO3的28.2 %提高到添加的71.7 %。吳昌銀等（1999）的研究表明，AgNO3在普通白菜子葉的離體再生中是必須的。大多數研究認為AgNO3之所以促進植物培養物的再生，可能是由于 Ag+競爭性結合位于細胞間膜的乙烯受體部位從而抑制乙烯活性，并且干擾乙烯信號傳遞途徑，減輕培養過程中產生的乙烯對不定芽發生及形態建成的抑制作用，從而促進器官發生和體細胞胚胎發生（Chi et al.，1991）。

但當AgNO3濃度超過某一臨界值時，對外植體分化反而有抑制作用，導致外植體形成畸形芽，不定芽分化率急劇下降。高武軍等（2002）在油菜離體培養上也有類似報道。這可能是由于 Ag+是重金屬，濃度太高時會對植物產生毒害作用（Mckeron & Yang，1989）。因而關于AgNO3的作用機理有待深入研究。

4 結束語

影響白菜類蔬菜作物離體再生的各種因素是相互作用的，通過選擇適宜的外植體類型和最佳生理時期，改良培養條件等方式，誘導控制其分化和發育的分子開關（molecular switch）的開放等，綜合所有的因素進行優化才能獲得高效的白菜類蔬菜離體培養再生體系（邢德峰 等，2003）。從總體研究來看，白菜類蔬菜離體再生系統仍不完善，再生頻率普遍不高，有關提高白菜類蔬菜離體再生頻率和遺傳轉化率的生理生化機制研究仍需進一步加強。

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