大白菜裂球性狀的遺傳與RAPD標記

牛 娜 鄭晨光 張魯剛 胥宇建 張立志 付文婷

（西北農林科技大學園藝學院，農業部西北園藝植物種質資源利用重點開放實驗室，陜西 楊凌 712100）

大白菜〔Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕屬十字花科蕓薹屬，原產于中國，栽培歷史悠久，是蕓薹屬植物中具有較高經濟價值、營養價值和研究價值的重要葉菜類作物之一。大白菜不僅在我國有著廣泛的分布和栽培，而且在日本、朝鮮、韓國及南亞國家也有著廣泛的栽培。大白菜結球性狀直接關系到大白菜的產量和商品性，特別是早熟大白菜，一旦裂球，基本上失去商品價值。因此，提高大白菜的耐裂球性是大白菜育種的一個重要目標，但有關大白菜裂球方面的研究國內外尚未見報道。而在同屬蕓薹屬的甘藍作物上已有一些研究，主要集中在甘藍裂球性的解剖學特征（王麗娟和秦智偉，1994）、性狀的配合力和遺傳力（莊木 等，2009）、內源激素的含量與裂球性的關系（曾愛松 等，2009）以及栽培因子對裂球性的影響（秦智偉 等，1994）等方面，尚未見分子標記方面的報道。

本試驗以大白菜分離群體為試材，從建立大白菜裂球性狀的分級標準入手，在分析大白菜裂球性狀遺傳規律的基礎上，篩選與裂球基因連鎖的分子標記，以期為耐裂球性大白菜品種選育和分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試2套大白菜材料F1均有裂球現象，均由西北農林科技大學園藝學院大白菜課題組提供。

材料A：親本分別為自交不親和系06J31和自交系92S24，雙親正反交F1，F2為06J31×92S24的單株自交群體。06J31葉淺綠色，葉球疊抱，近圓球形，葉球高12 cm，球寬10.5 cm，生育期50～55 d；92S24葉綠色，葉球疊抱，倒卵形，生育期55～60d。F1葉球頭球形，疊抱，結球極緊實，腋芽不發達，葉球高22.8 cm，球寬14.2 cm。

材料B：親本分別為自交不親和系06J31和05S50，雙親正反交F1，F2為06J31×05S50的單株自交群體。05S50株型小而緊湊，葉球高15 cm，球寬12 cm，外葉深綠，葉球疊抱，生育期50～55 d。F1葉球頭球形，疊抱，結球極緊實，腋芽不發達，葉球高17 cm，球寬12 cm。

親本材料結球松散，緊實度較低，正常情況下不表現裂球性。

1.2 方法

試驗材料B、A分別于2008年8月5、10日大田播種育苗，育苗期間按常規管理（鈕心恪，1984）。材料B于8月24日定植，材料A于9月2日定植。大田定植后，單株編號，葉球成熟期連續觀察葉球變化。以材料A的F2群體為材料，進行RAPD分子標記研究。

1.2.1 F2群體裂球基準時期及最佳分析時期的確定 以F1群體的成熟期（80%植株葉球達到緊實時的天數）作為F2群體裂球記載的基準時期，在此基礎上延遲生育期，每隔5 d觀察1次裂球性狀，至群體裂球率不再變化為止。分析群體裂球植株增加速率，統計裂球率。

1.2.2 裂球性狀分級標準的確定及遺傳規律分析 從裂球基準時期開始，連續觀察大白菜葉球開裂變化情況，分析裂球變化的范圍，確立了裂球性狀分級標準。

零級：葉球無裂葉；一級：葉球有1～3片葉裂；二級：葉球有4～5片葉裂，且葉球裂縫深度/葉球縱經≤0.2；三級：0.2<葉球裂縫長度/葉球橫徑≤0.4，0.2<葉球裂縫面積/葉球表面積≤0.4，0.2<葉球裂縫深度/葉球縱徑≤0.3；四級：0.4<葉球裂縫長度/葉球橫徑≤0.7，0.4<葉球裂縫面積/葉球表面積≤0.6，0.3<葉球裂縫深度/葉球縱徑≤0.5；五級：葉球裂縫長度/葉球橫徑＞0.7，葉球裂縫面積/葉球表面積＞0.6，葉球裂縫深度/葉球縱徑＞0.5。

按照上述裂球性狀分級標準完成田間調查后，參照孟德爾遺傳規律進行初步分析，并進行適合性檢驗。數據采用DPS軟件進行統計分析（唐啟義和馮明光，2002）。

1.2.3 模板DNA提取 親本、F1及F2單株的基因組DNA提取采用李永明和趙玉琪（2001）的方法，并參照王綺等（2006）方法，稍有改動。操作方法的改進點：取0.2 g幼嫩葉片裝入1.5 mL離心管中，在盛有液氮的容器中預冷，取出時離心管中留一點兒液氮，然后迅速研磨成粉末。

1.2.4 RAPD擴增 采用25 μL反應體系，包括1×緩沖液，2.5 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.3 μmol·L-1引物，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 20ng。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸90s，45個循環，72 ℃延伸10min。最后在1.5 %瓊脂糖凝膠上電泳分離，電泳緩沖液為1×TAE，電泳后先在EB中染色，然后在紫外燈下觀察并照相。隨機引物購自上海生工生物工程技術服務有限公司，Taq聚合酶購自寶生物（大連）有限公司，DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2.5 DNA混合池建立及引物篩選 根據田間調查結果，在F2分離群體中隨機抽取零級（即不裂）和裂球程度較高的四至五級植株各10株，分別等量混合各單株DNA，構建裂球和不裂球DNA池，以兩個DNA池為模板，采用BSA法（Ajisaka et al.，2001）進行RAPD引物篩選。為了使所得標記更加準確，不受環境等條件影響，選取早期裂球的植株。

1.2.6 遺傳連鎖分析 應用JoinMap 3.0軟件計算遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 裂球性狀統計基準時期和最佳分析時期的確定

材料 A、材料 B的 F2群體分別在定植后75 d和60d有80%葉球達到緊實，作為裂球情況統計的基準時期。對2套材料田間調查統計分析表明，大白菜裂球的多少受延長生育期天數的影響明顯（圖1），至大白菜植株幾乎不再生長為止（一般為延長生育期 30～35 d），裂球株數隨著生育期的延長而增多，這樣很難分析裂球性狀。為了明確其遺傳規律，需要確定一個相對最佳時期來分析該性狀。

從圖1可以看出，2套材料F2群體單株的裂球發生規律基本一致，在延長生育期20d時可以看作裂球發生的臨界期，此時裂球株數集中出現，形成裂球發生高峰，累計裂球株數約占總裂球株數的80%；此后裂球率日趨降低，至延長生育期30d以后，群體裂球株數幾乎不再發生。因此，可將延長生育期20d作為裂球性狀分析的最佳時期。

圖1 F2群體裂球率的動態變化

2.2 正反交F1裂球期方差分析

在最佳分析時期，材料A正反交F1裂球率分別為26.3 %、31.5 %，材料B正反交F1裂球率分別為33.3 %、25.0%。

由表1可見，2套材料正反交組合間差異均不顯著，這說明大白菜裂球性狀是受核基因控制的，與細胞質遺傳無關。

2.3 F2群體裂球性狀遺傳分析

分析2套材料在F2延長生育期20d時裂球性狀的分離情況，發現2套材料均在延長生育期20d時不裂球株數與裂球株數的分離比例（不裂球∶裂球）接近3∶1，因此初步認為該性狀可能受1對主效基因控制。

對2套材料F2群體裂球性進行χ2測驗（表2），結果表明：延長生育期20d時，χ2值均<，符合3∶1的分離比例；由于材料A較材料B定植晚、生育期長，材料A延長生育期20～25 d和材料B延長生育期10～20d的不裂球與裂球的分離比例均符合3∶1的比例，2套材料所表現的這種時間差異，除了與材料本身（遺傳因素）有關外，可能與生長期的環境條件尤其是溫度也有很大的關系。

表1 F1裂球期的方差分析

上述分析表明大白菜裂球性狀至少受1對主基因控制，同時還受到微效基因和環境條件的影響。

表2 大白菜F2裂球性狀田間觀察結果

2.4 RAPD引物篩選及標記分析

用本實驗室保存的600個RAPD引物對裂球和不裂球DNA池進行擴增，不同引物擴增的條帶數目為0～11條譜帶，擴增片段大小為100～2000bp，有483個引物擴增出穩定而清晰的條帶，其中只有87個引物在兩池之間的擴增條帶存在差異，表現出遺傳多態性。

在87個引物中，表現出明顯擴增多態性的引物有34個，占總引物的5.7 %。經3次以上重復篩選，有15個引物在兩池間都表現出較好的多態性。經親本、F1及F2驗證，僅有1個引物S15在不裂球池內擴增出相同大小且清晰的特異條帶（圖2）。

圖2 引物S15對親本、F1和F2的PCR擴增結果

對材料A的148個F2單株DNA用S15進行PCR擴增，有110個單株擴增出與親本06J31相同的條帶，38株未擴增出此特異條帶，特異條帶為222 bp。特異條帶有/無（110/38）比率的卡方測驗χ2值為 0.036（<=3.84），符合3∶1分離比例。認為該標記是與控制大白菜裂球性狀的主效基因相關的RAPD標記。發生交換的植株有13株，交換率為8.784 %。應用JoinMap 3.0軟件計算，該標記與裂球基因間的遺傳距離為8.876 cM。

3 結論與討論

3.1 關于裂球標準的劃分

研究裂球性首先要進行裂球性狀的判斷與分級，大白菜裂球多以葉球開裂為主，但也有根裂現象的發生。實際生產中，大白菜葉球開裂的方式可以分為橫裂、縱裂、混合裂和不規則裂等。因此，用單一指標難以準確評價單株裂球性，本試驗采用葉球三維綜合指標進行大白菜裂球性狀的分級。該分級標準簡單明了、且易于掌握，尤其方便田間調查使用，但由于試材有限，該分級標準比較粗，可在今后的研究中不斷細化、完善。

本試驗發現大白菜葉球開裂多發生在結球后期，裂球初始階段發生裂球的植株少、葉球開裂程度低且變化緩慢，而在葉球成熟后期裂球植株逐漸增多、開裂速度加快。因此在分級標準劃分時，裂球程度低的級別間級差小，以后逐漸增大，較高的裂球級別之間級差較大，使分級標準更加準確，為大白菜裂球程度的劃分提供依據。

3.2 關于大白菜裂球性狀的遺傳規律

在傳統的自交系選育中沒有有意識地進行裂球性的選擇，因此經濟性狀一致的自交系其控制裂球性的相關基因位點是隨機的，如果雙親帶有裂球基因，其配制的雜交一代就可能出現裂球植株，這不能簡單的用顯隱性解釋。鑒于大白菜裂球現象的遺傳復雜，本試驗利用的是單株自交的F2群體，這可以消除親本裂球性基因位點不純合帶來的遺傳復雜性，取得相對準確的結果。

本試驗通過對兩套分離群體的調查分析認為大白菜裂球性狀為質量-數量性狀（莫惠棟，1993），耐裂球為顯性，至少有1對主基因控制其性狀的表現，同時還受到微效基因和環境條件的共同影響。這與秦智偉等（1994）認為甘藍裂球性主要由遺傳因素引起的研究結果相似。本試驗使用的材料腋芽不發達，裂球的原因主要是內葉不斷生長導致外葉斷裂，其遺傳規律反映了內葉生長和外葉韌度兩方面的特性，具體以那一方為主尚不能確定，另外在實踐中也常看到有些腋芽發達的大白菜品種容易裂球，這種情況與內葉生長關系不大，其與本試驗材料可能屬于不同的裂球類型，但尚無相關報道。

3.3 大白菜裂球性狀最佳分析時期的確定

大白菜裂球性狀為質量-數量性狀，裂球率隨著生育期延長而變化，因此確定適宜的統計時期十分重要，本試驗以形成裂球發生高峰的時期作為該性狀的最佳分析時期比較符合實際，分階段統計分離比例表明此時的分離比例接近孟德爾遺傳規律分離比例，也有利于主效基因的發現與分子標記研究，本試驗是可行的。

3.4 大白菜裂球性狀的分子標記

本試驗以材料A的F2群體為材料，找到了與裂球基因緊密連鎖的RAPD分子標記S15-222，其與裂球基因的遺傳距離為8.876 cM，由于裂球性狀也不同程度地受溫度、水分等環境條件的影響，所以，因環境作用而表現為裂球的不裂球單株則不屬于發生交換的范疇。因此，可以推測S15-222與裂球基因間的遺傳距離≤8.876 cM，因此該標記可以有效地應用到大白菜裂球性狀的分子標記輔助育種中，而且該標記是否適合材料B，還有待于驗證。

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