多糖硫酸化修飾和硫酸酯多糖的抗病毒活性研究進展

金秧敏,王春花,王鑫瀅,張秀英

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱150030)

病毒感染性疾病一直是威脅人類健康的世界性難題,也是動物常發的主要疾病。這是因為一方面病毒易發生多種變異,而且它們完全依賴感染的宿主細胞增殖和存活,另一方面作為抗病毒藥物所必須具備的最重要的條件是對細胞內的病毒有抑制作用,而對細胞的正常代謝無影響使得開發有效的針對病毒感染的治療制劑存在諸多困難,至今仍然沒有有效治療藥物,目前多用核苷類似物用于病毒性疾病的治療,然而這些藥物存在諸多問題：對細胞的毒副作用,抗藥變異株的出現,對與宿主細胞基因組整合的病毒以及對潛伏病毒感染的治療有一定困難等[1]。總之抗病毒藥物研究還未取得突破性進展。鑒于病毒感染危害的嚴重性和廣泛性,人們更關注開發新的、具有不同作用機制、且毒副作用較小的抗病毒制劑。

多糖作為一類重要的天然生物活性物質,具有無細胞毒性且質量通過化學手段容易控制等優點,已成為當今新藥的發展方向之一。但天然藥物的藥效相對較低,通過分子修飾的方法可以提高其功效。其中硫酸化修飾是近年來多糖結構修飾的重要方向之一。近年的研究已經證實,多種多糖經硫酸化修飾后,會使其具有或加強抗病毒活性。

1 多糖的硫酸化修飾方法

多糖的硫酸化反應原理是在路易斯堿溶液中由SO3 H+取代多糖羥基中的H+,經中和而得的多糖硫酸鹽。主要方法有濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法,Nagasawa方法,氯磺酸-吡啶法和氯磺酸-甲酰胺法。濃硫酸法和三氧化硫-吡啶法由于其酯化程度和回收率不高,因此現在應用較少。

Nagasawa方法：呋喃型多糖常采用此法。多糖溶于二甲基亞砜中,加入哌啶-N-磺酸,混和物加熱反應,再加入飽和碳酸氫鈉溶液,透析,濃縮,冷凍干燥后即得硫酸酯化的呋喃型多糖。

氯磺酸-吡啶法：即Wolfrom 方法,用氯磺酸與吡啶的混合物作為硫酸酯化試劑對多糖進行硫酸酯化。此法試劑簡單易得,反應條件相應地簡單,產物回收方便,回收率和取代度均較理想。但是該試劑在冷藏下只保存一周,不過最好新鮮制備。

氯磺酸-甲酰胺法：此方法與氯磺酸-吡啶法類似,不同之處只是先將多糖溶解在甲酰胺中,這樣有利于多糖的溶解,能提高硫酸酯多糖的回收率。

2 影響硫酸酯多糖抗病毒活性的主要因素

2.1 硫酸基團 硫酸基的引入會引起多糖理化性質,特別是立體構象的變化,而構象變化恰恰是活性變化的決定因素。研究發現,有的多糖本來無抗病毒活性,經硫酸化后表現出抗病毒活性,例如小分子量的牛膝多糖有增強免疫的作用,但無抗病毒活性,若引入一定量的硫酸基團后,就有較強的抑制乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表達以及抗單純皰疹病毒I型的活性[2]。相反的,有抗病毒活性的硫酸酯多糖被脫去硫酸根后,即降低或失去抗病毒活性,例如,肝素鈉N-脫硫酸化及O-脫硫酸化都會降低其抗病毒活性,說明其抗病毒活性不僅依賴于負電荷,而且特定的結構參與了抗病毒活性的生成,尤其是O-脫硫酸化顯得極為重要[3]。

另一方面,硫酸基取代度,即每二糖單位中的硫酸基數量,是影響肝素等硫酸多糖抗病毒作用的一個重要因素。試驗表明,多糖硫酸酯的作用與其取代度在一定范圍內呈正相關[4],以D-葡萄糖和D-半乳糖為側鏈的纖維素和支鏈纖維素硫酸酯化后,可表現出抗HIV活性,而且其抗HIV活性隨硫酸基團取代度的增加而增強。一般來說,硫酸根含量在每個糖殘基平均為1.5～2.0時最佳。

2.2 分子量 硫酸酯化多糖的抗病毒作用與分子量的大小有很大的關系。但不同多糖發揮抗病毒作用的最佳分子量各不相同,其抗病毒活性隨著大于或小于該分子量而迅速降低。如硫酸葡聚糖抗HIV病毒活性隨著相對分子質量的增加而增加,相對分子質量10 000時達到最大,在10 000～500 000之間保持最大活性,分子量再增加則其抗病毒活性將會下降[5]。右旋糖酐酯化后,其分子量在5 000～50 000之間時,抗 HIV活性隨分子量增大而增強[6]。高分子量的硫酸多糖即使在比較高的濃度也沒有表現出明顯的細胞毒性,而對多種包膜病毒顯示出其抗病毒活性;一般來說中等分子量多糖的抗病毒活性大于高分子量及低分子量的多糖。

2.3 化學結構 多糖經硫酸化修飾后,分子結構發生變化,其空間結構也發生變化,其抗病毒活性也會隨之變化。沃爾默特認為,許多糖單位的氫基被SO-3基團取代后,糖環構象可能扭曲或轉變并利于形成非共價鍵,而且帶同性電荷基團間的相互排斥作用導致卷曲構象呈伸展和剛性狀態。當多糖環被硫酸基修飾,這些陰離子基團間的排斥作用使糖鏈鏈段伸長;而且部分硫酸基可能會和糖環上的羧基形成氫鍵,因而在糖鏈局部可能形成了螺旋結構,呈有活性的高級構象,且有序性增大。因此,當多糖的結構發生變化時,其抗病毒活性發生相應的改變[7]。

3 硫酸酯化多糖的抗病毒作用

綜合目前國內外研究來看,多糖對艾滋病病毒、皰疹病毒及流感病毒等具有良好的抑制作用,且具有活性的多為硫酸多糖。經人工硫酸化修飾可使原來不含有硫酸根或硫酸根含量低的多糖表現出較強的抗病毒活性[8]。

自1987年發現硫酸酯化葡聚糖具有抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)活性以來,人們對這類多聚陰離子化合物產生了極大興趣和關注,特別是關于該類多糖的抗病毒研究十分活躍,它有可能成為繼HIV逆轉錄酶活性抑制劑(RTIs)、蛋白酶抑制劑(PIs)和融合酶抑制劑(INIs)之后又一類潛在的新型抗HIV藥物。

辛現良等[9]從南海多種海藻硫酸化多糖中篩選和分子修飾得到的聚甘古酯-海洋硫酸多糖911,其重均分子量為6 000,在體內外均可抑制HIV-1的增殖,是一種高效的新型抗HIV-1海洋藥物。于囡等[10]從海洋貝類扇貝裙邊中提取、純化得到的酸性粘多糖(SS-GAG)-扇貝裙邊糖胺聚糖具有很強的抗單純皰疹病毒的作用。SS-GAG不同濃度均能有效保護經HSV-I感染的Vero細胞和宮頸癌(Hela)細胞,使細胞活性增強;并減弱HSV-I導致的細胞病變效應(CPE),抑制病毒的復制,阻斷HSV-I對細胞的侵入,但沒發現其對病毒的直接殺傷作用。盧宇等[11]從淫羊藿葉中分離純化得到淫羊藿多糖,按正交試驗設定氯磺酸-吡啶法的9種修飾條件,對淫羊藿多糖進行硫酸化修飾,得到9種硫酸化淫羊藿多糖,試驗證明其抗雞傳染性腔上囊病毒的能力均有不同程度的提高,且其能力與硫酸基取代度和糖含量有一定的相關性。

4 硫酸酯多糖的抗病毒作用機制

一般認為,多糖的抗病毒機制是對病毒復制早期階段進行抑制,有研究資料表明,硫酸酯化多糖的主要抗病毒機制可能是硫酸基團的負電荷與病毒上蛋白的正電荷通過靜電作用結合,進而阻止了病毒對細胞的吸附,封閉了包膜病毒與細胞受體結合的部位。雖然病毒種類不同,但抗病毒的機制類似。

4.1 抗艾滋病病毒(HIV)的作用機制 硫酸酯多糖首先通過干擾HIV與宿主細胞的吸附而發揮作用。硫酸酯多糖是陰離子多聚體,帶有負電荷,可與HIV-1的外殼糖蛋白gp120上帶正電荷的的V3環區域結合,使病毒顆粒不能與CD4+細胞結合。另外由于它在結構上和細胞表面的糖胺聚糖相類似,能以競爭性抑制的方式來阻止病毒與細胞的結合,形成無感染的硫酸酯多糖-病毒復合物;同時它還是CD4+細胞表面分子的模擬配體,能夠直接與T細胞表面受體結合,阻礙病毒與CD4+細胞的吸附過程[12]。

硫酸酯多糖的抗HIV病毒作用還可通過抑制逆轉錄酶活性來影響病毒的逆轉錄過程,已經有體外試驗證明,硫酸酯化多糖能有效抑制HIV-1的逆轉錄酶活性,未硫酸化的多糖幾乎沒有這種作用。有學者認為,硫酸酯多糖分子中的硫酸化側鏈與RNA模板引物上的某些酶具有相同的結合位點,從而產生競爭性抑制作用[13]。但究竟是通過何種機制來影響病毒的逆轉錄過程目前還不清楚,有待進一步的研究來闡明。

4.2 抗單純皰疹病毒(HSV)的作用機制 對于HSV有報道認為硫酸酯化多糖可與HSV中的糖蛋白C(gC)競爭性的抑制細胞表面受體分子硫酸乙酰肝素(HS)[14],主要通過與病毒糖蛋白上帶正電荷的富精氨酸區域結合來阻止病毒與細胞結合。主要是因為硫酸酯化多糖是一類多聚陰離子,帶有負電荷能與病毒包膜糖蛋白上的正電荷結合,導致這些區域的屏蔽作用,從而阻止病毒與細胞結合。

4.3 抗流感病毒(IFV)的作用機制 硫酸酯多糖可阻止IFV中糖蛋白血凝素與宿主細胞膜表面多糖受體末端的N-乙酰神經氨酸結合,阻止使病毒附著于易感細胞表面[15]。廖灶輝等[16]從海洋藻類龍須菜中提取多糖,并證明龍須菜硫酸化多糖可以通過干擾病毒對宿主細胞的吸附,抑制病毒的復制實現其抗流感病毒的作用。且證明其抗病毒能力在硫酸根含量為13.25%,DS為1.16時其抗病毒作用最好。

5 硫酸酯多糖抗病毒作用的應用前景

隨著對天然藥物認識的不斷加強,海洋藥物抗病毒活性的研究越來越受國內外學者的關注。目前中國已從海洋有機體中提取了一種硫酸化多糖,即硫酸多聚甘露醛酸多糖(SPMG),作為用于治療AIDS獲得性免疫缺陷綜合征,又稱艾滋病的候選藥物已經進入臨床Ⅱ期試驗階段[5]。SPMG主要是通過其特殊位點與CD4分子陽性細胞結合,以此來介導在AIDS感染者中的抗病毒作用,有望不久后用于AIDS的治療,為有效治AIDS發揮積極的作用。

硫酸酯化多糖作為新型抗病毒藥物的研究已經取得了一定的進展,相信隨著科學技術的進步、新研究方法的應用、對硫酸酯化多糖構效關系認識的加深以及對硫酸酯化多糖抗病毒作用機制的不斷闡明,相信將有更多新的高活性低毒性的硫酸酯化多糖用于臨床抗病毒治療中。

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