布魯氏菌病實驗室診斷研究進展*

高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病實驗室診斷研究進展*

高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種重要人獸共患病。根據致病性和宿主特異性,將布魯氏菌分為6個種19個生物型,即羊種布魯氏菌(B.meltensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)、犬種布魯氏菌(B.canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)。另外,從海洋動物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的布魯氏菌,定為海洋種布魯氏菌(B.maris)。據中國CDC報告,2005-2008年全國布魯氏菌病新發病人分別為 18 416、19 013、21 901、30 002 例 ,人布魯氏菌病發生嚴重,形勢十分嚴峻。流行病學調查表明,感染來源主要是患布魯氏菌病的羊,其次是牛及其它動物。因此加強對動物布魯氏菌病的檢疫監測力度十分重要。本文就布魯氏菌病實驗室診斷方法研究進展作一綜述。

1 免疫學診斷技術

1.1 血清凝集性試驗 布魯氏菌病傳統檢測方法有血清凝集試驗、全乳環狀試驗(MRT)和抗人免疫球蛋白試驗(Coomb's)等。經典血清凝集試驗包括標準試管凝集試驗(SAT)和平板凝集試驗(PAT)等在發達國家已基本上停止使用,取代方法是緩沖布魯氏菌抗原試驗,如虎紅平板凝集試驗(RBT)等?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌株經培養、滅活、離心后用虎紅染色液染色,懸浮于乳酸緩沖液中制成。RBT特異、敏感、價廉、操作簡便,在國際貿易中,緩沖布魯氏菌抗原試驗是牛、羊、豬種布魯氏菌病的指定試驗。在我國,RBT也用于人布魯氏菌病的監測的初篩試驗。乳牛MRT依然是乳牛布魯氏菌病監測的主要方法。由于凝集性試驗是基于檢測針對布魯氏菌多糖O-鏈的抗體,因此會與有類似多糖O-鏈的細菌如耶爾森氏菌O∶9等出現交叉反應。

1.2 補體結合試驗(CFT) CFT至今仍是布魯氏菌病診斷的重要方法,是牛、羊及綿羊附睪種布魯氏菌病國際貿易指定試驗,并作為確診用。Adone等〔1〕以無抗補體活性的羊種布魯氏菌B115 R型菌株為抗原建立檢測抗體的CFT(B115-CFT),并通過對RB51免疫的牛和水牛、綿羊附睪種布魯氏菌感染的羊和犬種布魯氏菌感染的犬血清中R型抗體進行檢測表明,B115-CFT與RB51-CFT和HSE(布魯氏菌熱鹽抽提物)-CFT相比,具有很高的敏感性和特異性。由于豬的補體會干擾豚鼠補體的作用,導致實驗的敏感性降低38%～40%,因而CFT不適合豬種布魯氏菌病的檢測。

1.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA) ELISA是一種與CF T效果相當的方法,操作更方便,既可以作為確定檢測,又可以作為篩選和鑒別用。但只有用于牛布魯氏菌病的ELISA是國際貿易指定的,這種ELISA方法不僅用于血清學診斷,還可用于乳汁檢查〔2〕。用于其他種布魯氏菌病檢測的ELISA方法也是研究的熱點。Fel＇dsherova等〔3〕應用鼠抗流產布魯氏菌脂多糖(LPS)的單克隆抗體建立了用于牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌和豬種布魯氏菌鑒定的ELISA,該法具有高度的特異性和敏感性,同時不與小腸結腸炎耶爾森氏菌O∶3、O∶9及鼠傷寒沙門氏菌和土拉熱弗朗西斯氏菌反應。檢測抗原的最低濃度可達0.05-0.1 ng/mL。Nielsen等〔4〕應用抗牛種布魯氏菌S1119.3株S-LPS的O糖鏈(OPS)共同抗原表位且不與蛋白A/G結合的特異性單克隆抗體建立了第二代競爭ELISA(CELISA),該方法通過單克隆抗體與牛被檢血清中的抗體與S-LPS的競爭結合,用酶標蛋白A/G顯色來進行檢測。方法特異、敏感,并能區分牛種布魯氏菌S19疫苗株免疫。Cakan等〔5〕應用商品化布魯氏菌病IgG ELISA和IgM ELISA試劑盒對人布魯氏菌病進行檢測表明,當IgG ELISA和IgM ELISA同時應用時,對于疾病的診斷具有很高的敏感性。ELISA的效果關鍵在于抗原的選用。標準化牛種布魯氏菌病ELISA檢測方法使用了S-LPS抗原。

1.4 免疫組化法(Immunochemistry) Ilhan等〔6〕應用免疫組化法檢測了羊種布魯氏菌抗原在流產胎兒組織中的存在與分布情況。在110份流產胎兒樣本中檢出抗原的有33份(占30%)。33份陽性樣本中檢測到抗原的,肺25份(占 22.7%),肝 21份(占19%),脾13份(占 11.8%),腎 6份(占5.4%)?？乖饕挥诜尉奘杉毎椭行粤＜毎案慰莘袷霞毎募毎ど?。結果證明,免疫組化法可用于羊種布魯氏菌引起的綿羊流產福爾馬林固定樣本的檢測。

1.5 膠體金免疫層析檢測技術(GICA) Kim等〔7〕用犬種布魯氏菌的抽提物作為檢測抗原建立了檢測犬血清布魯氏菌病抗體的GICA。分別用血液培養、2-巰基乙醇快速篩選凝集試驗(2-ME RSAT)和GICA對發生布魯氏菌病的10個不同圈舍的犬群進行檢測,陽性率分別為24.8%,39.5%和39.1%,2-ME RSAT和GICA之間的κ值為0.89。結果表明GICA與常規的凝集試驗和細菌學檢測具有同樣的敏感性和特異性。朱明東等〔8〕建立了診斷牛布魯氏菌病的GICA,通過對布魯氏菌病病牛和健康牛不同血清用量的測試,確定GICA診斷牛布魯氏菌病最佳血清用量為10μ L,檢測敏感性和特異性分別達到91.3%和 97.3%,Youden指數為0.886;GICA、斑點免疫金滲濾法(DIGFA)及SAT檢測結果比較三者無統計學意義(P＞0.05)。結果表明,GICA診斷牛布魯氏菌病,不僅具有試劑敏感、特異,且血清用量少,操作簡便快速,適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學調查及現場檢測。朱明東等〔9〕還采用 GICA、DIGFA和 SAT對不同流行區布魯氏菌病人群抗體平行檢測。結果重流行區、監測地區和非疫區人群抗體陽性率,3種方法之間差異無統計學意義(P＞0.05);GICA和SAT平行檢測布魯氏菌病重疫區人群抗體陽性符合率為94.2%。GICA和SAT平行檢測布魯氏菌病非疫區人群抗體陰性符合率為99.6%。GICA檢測不同疫區之間人群抗體陽性率差異有統計學意義(P＜0.01)。說明GICA不僅能及時快速發現患者,而且可監測疫情,反映流行程度,在布魯氏菌病不同流行區具有較好的推廣應用前景。

2 分子生物學檢測——PCR及其衍生技術

PCR是布魯氏菌病分子生物學檢測和病原分型的重要手段,同時也是當今研究的熱點。早在1994年,Bricker等〔10〕根據布魯氏菌染色體中的遺傳成分IS711種特異性定位引起的多態現象就建立PCR檢測方法,并根據在距IS711不同距離的引物雜交擴增產物大小來進行種型鑒定,能將布魯氏菌牛種(1 、2、4 型)、羊種(1 、2、3 型)、豬種(1 型)、綿羊附睪種區分鑒別,并將該方法稱為AMOS(abortus,melitensis,ovis,suis)PCR。后來他們改進了AMOS PCR,使之可以鑒別 S19和 RB51〔11〕。2003年Bricker等〔12〕在原有的基礎上又改進了AMOS PCR,建立了 Bass(brucella abortus species-specific)PCR,能從布魯氏菌疫苗株、其他種布魯氏菌和非布魯氏菌中區別牛種布魯氏菌流行株(1、2、4型),是牛種布魯氏菌篩選的一種可信賴方法。Ocampo等〔13〕通過AMOS-ERY PCR 和以IS711為探針的Southern blot雜交發現,牛3型除有牛3a外,還有牛3b生物型,進而用IS711 AMOS作為引物擴增出長1.7kb產物,可以鑒別出牛3b型、牛5、牛6和牛9型。Whatmore等〔14〕利用PCR擴增產物長度多態性可以將布魯氏菌牛種、羊種、沙林鼠種、犬種、豬種、綿羊附睪種以及海洋種布魯氏菌區別開來。Fayazi等〔15〕用一個長度為 25bp的引物,經PCR擴增后豬種菌得到420bp產物,牛種菌得到420bp和650bp 2個條帶,從而將豬種和牛種布魯氏菌鑒別開。Cloeckaert等〔16〕應用 PCR擴增 bp26基因得到1 029 bp和1 900 bp,其中1 029 bp為布魯氏菌6個種共有的產物,1 900 bp為海洋種布魯氏菌所特有。2001年,Cloeckaert等〔17〕又發現利用omp2基因的多態性也可以將海洋種與其他布魯氏菌區分開。Redkar等〔18〕應用 Real-Time PCR鑒別了布魯氏菌的牛、羊、豬 3個種。Probert等〔19〕也用RT-PCR技術鑒別牛種、羊種和其他種布魯氏菌。Hinic等〔20〕建立的即可常規操作又可 Real-Time PCR的PCR新方法,特異性強,可鑒別6個種的布魯氏菌。Vladyslava等〔21〕應用 PCR可以鑒別布魯氏菌的6個種,并能將豬4型單獨鑒別出來。López等〔22〕建立了一種多重PCR實驗(階梯法),7個實驗室通過對來自不同動物和不同地區的625個布魯氏菌株的檢測表明,一步法可以鑒別古典布魯氏菌種,包括海洋種及疫苗株S19、RB51和Rev.1。

Garcia等〔23〕用 DdeⅠ消化omp31b基因擴增產物做PCR-RFLP,通過對37株代表所有種和型的參考株和野毒株分析,可在種水平上鑒別牛種、羊種和綿羊附睪種布魯氏菌。Le等〔24〕應用多位點可變數串聯重復分析(MLVA)方法,使用MLVA-15可以對布魯氏菌屬21個菌株進行分型,并認為MLVA-15可以代替傳統分型方法進行種、型鑒定。Whatmore等〔25〕依據21個可變數串聯重復片段(VNTR)基因座(包括8個已報告的和13個以前未報告的)建立的分子亞類鑒定方法——VNT R方法,通過對來自世界各地的121株布魯氏菌進行檢測證明,VNTR是一種好的分型方法,并可用于流行病學追蹤和菌株親緣關系確定。王遠志等〔26〕利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(HOOF-Prints)對綿羊種布魯氏菌019株VNTR的8個位點進行PCR擴增和序列分析,可鑒定該菌株,并有望彌補傳統鑒定方法之不足。

Ohtsuki等〔27〕根據流產布魯氏菌 BCSP31株的基因序列設計兩組用于6個種布魯氏菌鑒別的環介導等溫擴增(LAMP)的特異性引物,通過對6個種22株布魯氏菌和18個種28株非布魯氏菌的檢測表明,對布魯氏菌的檢測具有特異性(35min,63℃)和敏感性(10fg基因組DNA)。另外該方法還可用于污染牛奶和感染鼠器官中菌體DNA的檢測。Montagnaro等〔28〕應用牛種布魯氏菌 O-LPS與FITC結合作示蹤劑建立了熒光偏振試驗(FPA),通過對890份水牛血清(CFT檢測,526份為陽性,364份為陰性)進行RBT和FPA的平行檢測,與CFT相比,敏感性分別為84.5%和92.6%,特異性分別為93.1%和 91.2%,檢測結果表明,FPA與CFT檢測效果相當可以替代RBT,并且具有可靠、高通量、易操作,適于野外血清抗體調查。

3 結 語

目前傳統的檢測方法,如 SAT、PAT、RBT、MRT、Coomb's、CFT等仍然是國際貿易和許多發展中國家進行布魯氏菌病檢疫、監測的重要方法。間接 ELISA、CELISA、IgG ELISA和 IgM ELISA等方法敏感、特異,可用于血清抗體效價的檢測,野毒株的分型、自然感染與疫苗免疫的鑒別,并可用于大樣本檢測。免疫組化在組織中檢查病原及分布有其優點。GICA雖然不如CFT和ELISA敏感、特異,但操作方便,結果易于判斷,適合臨床調查和疫病普查。以PCR為代表的分子生物學技術不僅用于布魯氏菌種的鑒定,還因其能反映基因間存在的差異,因此可在基因水平上進行分型和疫苗株鑒定。未來的方向是研制簡單、特異、敏感,適合于野外和實驗室大樣本操作的血清抗體監測、病原檢測及核酸檢測方法。并以此為基礎,在布魯氏菌病較為嚴重的國家建立綜合防控體系,加強動物布魯氏菌病檢疫監督和凈化,從源頭上控制人的布魯氏菌病。

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R516.7

A

1002-2694(2010)01-0081-03

*內蒙古自治區高等學校研究項目(NJzy08165)

呼倫貝爾學院生命科學與化學學院,呼倫貝爾 021008

2008-12-12;

2009-03-25