雞生化基因位點(diǎn)檢測方法的建立及在SPF雞群中的應(yīng)用

韓凌霞，高鵬飛，2，劉霄磊，司昌德，曲連東

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，哈爾濱 15001; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

研究報(bào)告

雞生化基因位點(diǎn)檢測方法的建立及在SPF雞群中的應(yīng)用

韓凌霞1，高鵬飛1，2，劉霄磊1，司昌德1，曲連東1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，哈爾濱 15001; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

目的建立雞生化標(biāo)記檢測方法，用于SPF雞群的遺傳學(xué)檢測。方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測方法》，應(yīng)用乙酸纖維素板，建立SPF雞生化標(biāo)記位點(diǎn)的檢測方法。結(jié)果共有7種同工酶可以用于雞的生化檢測，其中血紅蛋白－β鏈(Hbb)的檢測組織為溶血素，轉(zhuǎn)鐵蛋白酶(Trf)的檢測組織為肺臟，碳酸酐酶－2(Car2)的檢測組織為肝臟或溶血素，異檸檬酸脫氫酶－1(Idh1)、蘋果酸酶－1(Mod1)、堿性磷酸酶－1 (Akp1)檢測組織為腎臟，酯酶－1(Es1)檢測組織為血清。結(jié)論建立了雞生化標(biāo)記檢測方法，并對(duì)BWEL－SPF雞群和Line－22雞群進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)都存在多態(tài)性。

SPF雞;生化標(biāo)記位點(diǎn);乙酸纖維板電泳法

無特定病原體(specific pathogen－free，SPF)雞是指排除了特定病原體的一類雞，屬于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物范疇，SPF雞及雞胚是動(dòng)物病毒學(xué)、禽病學(xué)、生命科學(xué)等研究的重要實(shí)驗(yàn)材料，也是禽流感疫苗、偽狂犬病疫苗、麻疹疫苗等生物制品生產(chǎn)的主要原材料，其遺傳學(xué)背景直接關(guān)系到病毒的復(fù)制能力、疫苗的產(chǎn)量以及對(duì)禽病的敏感性等，是必須考慮的一個(gè)重要生物學(xué)參數(shù)。

生化基因位點(diǎn)的編碼產(chǎn)物同工酶是生物體內(nèi)代謝過程中非常重要的調(diào)節(jié)酶類，具有多態(tài)性和共顯性，能直接反映蛋白質(zhì)水平的差異，在遺傳育種、種群結(jié)構(gòu)分析、分類及進(jìn)化等研究中具有獨(dú)特的意義。本研究利用乙酸纖維素板，參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測方法》［1］GB/T 14927.1－2001，摸索了針對(duì)雞的同工酶檢測方法，并對(duì)本單位保存的BWEL雞群和Line－22雞群等品系進(jìn)行了檢測。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BWEL－SPF雞群是我國唯一自主培育凈化的一個(gè)SPF雞品系，已封閉飼養(yǎng)15個(gè)世代。Line－22雞是另一個(gè)封閉群，已繁育3個(gè)世代。1日齡雌性BWEL－SPF雞5羽，1日齡Line－22雞群K2家系雌性5羽，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(黑)2006－2009】提供。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

DYY－6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、電泳微量點(diǎn)樣器和醋酸纖維板購于北京六一儀器廠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠遺傳檢測試劑盒購自中國藥品生物制品檢定所(批號(hào):0407)，檢測所用生化試劑均為分析純。

1.3 組織樣品的制備

將雛雞心臟采血，分別制備含5%檸檬酸鈉的抗凝血和不含抗凝劑的全血。將抗凝血離心，5000 r/m in，離心5 m in，棄上清。在細(xì)胞壓積內(nèi)加入4倍體積的蒸餾水，劇烈震蕩1 min，制備溶血素。另取部分肝臟、肺臟和腎臟，分別在研缽中加石英砂研磨，在1.5 m L的EP管中稱重，加2倍(體積/重量)蒸餾水勻漿，4℃12 000 r/m in，離心10 m in。上清在－20℃?zhèn)浯妗?/p>

1.4 同工酶在不同組織中表達(dá)情況的檢測

參照國家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系小鼠、大鼠生化標(biāo)記檢測方法》［1］制定的電泳和顯色方法，分別對(duì)所有被檢組織中的堿性磷酸酶－1(Akp1)、酯酶－1 (Es1)、異檸檬酸脫氫酶－1(Idh1)、蘋果酸酶－1 (Mod1)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Trf)、碳酸酐酶－2(Car2)和血紅蛋白－β鏈(Hbb)等7種同工酶的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。

2 結(jié)果

2.1 Akp1表達(dá)情況的檢測

顯色結(jié)果顯示，在肺、肝、腎和血液組織中，均能出現(xiàn)一條帶(圖略)，但腎組織中的條帶較清晰，被檢BWEL雞之間和Line－22雞之間，電泳速率存在差異，如圖1所示(彩插12)。

2.2 Es1表達(dá)情況的檢測

顯色結(jié)果表明，Es1在血清中出現(xiàn)一條帶，相對(duì)于Line－22－K2帶型一致，BWEL－SPF雞群個(gè)體之間的泳動(dòng)速度有差異，如圖2所示(彩插12)。

2.3 Idh1和M od1表達(dá)情況的檢測

Idh1和Mod1采用相同的顯色條件，結(jié)果表明，腎臟中出現(xiàn)較清晰的2條帶，BWEL雞群個(gè)體間帶型一致，而Line－22－K2的第5個(gè)個(gè)體(泳道10)表現(xiàn)為慢帶，如圖3所示(彩插12)。

2.4 Tr f表達(dá)情況的檢測

Trf屬于血清蛋白酶，但在肺、肝、腎、脾、心臟和溶血素等各組織中都有深淺、大小不同的條帶(圖略)，但帶型不同:血清中存在多態(tài)現(xiàn)象，多數(shù)為3條帶，少量存在4條帶;在溶血素中只出現(xiàn)2條帶，且與血清中的2條快帶位置一致;而在肺臟中均只表達(dá)1條帶，在BWEL－SPF雞中出現(xiàn)個(gè)體差異，Line－22－K2表現(xiàn)一致。如圖4所示(彩插12)。

2.5 Car2表達(dá)情況的檢測

Car2為紅細(xì)胞酶，通常采用溶血素進(jìn)行檢測。顯色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在雞的多種組織中都出現(xiàn)了條帶，而且含量較多，但帶型不同。在肝臟中多達(dá)5條以上，存在不少于4條帶，但肉眼觀察條帶接近，帶型相似。在溶血素中可以清晰判斷的有2條帶，且品系間無明顯差異。如圖5所示(彩插12)。

2.6 Hbb表達(dá)情況的檢測

染色結(jié)果表明，在溶血素組織中可以明顯看到1條帶，品系間無差異，如圖6所示(彩插12)。

3 討論

目前國內(nèi)外對(duì)雞的生化標(biāo)記位點(diǎn)的檢測多利用血漿蛋白酶進(jìn)行檢測，如利用Akp、Trf、Es1、血清酯酶［2－9］等，用于品種遺傳學(xué)背景的比較［10］，或者進(jìn)行多態(tài)性的分析。但是上述研究都只利用血液組織進(jìn)行了分析，使適用的同工酶位點(diǎn)有限，造成了獲得生物學(xué)信息的局限。

本研究中我們首先利用Akp1、Car2、Trf、Es1、Idh1、Mod1、Hbb、Gpd1和Es3等9個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)雞不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了摸索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gpd1和Es3在各組織中都不能形成清晰的帶型，而只有Hbb、Trf、Car2、Idh1、Es1、Mod1和Akp1等7種同工酶出現(xiàn)穩(wěn)定的帶型，具有較好的重復(fù)性，所以最終選定該7個(gè)位點(diǎn)，建立同工酶檢測方法。在進(jìn)行組織勻漿時(shí)，首先選擇了超聲破碎的方法，效果比較好，使組織中的同工酶較徹底的釋放出來，但破碎過程中產(chǎn)熱容易使酶失活，所以最終選擇研磨加遇冷蒸餾水的方式制備組織勻漿。

Akp1雖然在各種被檢組織上均出現(xiàn)條帶，而且在血清樣品中條帶較清晰，但在腎組織中的含量最高，因此選擇腎臟檢測Akp1位點(diǎn);Idh1和Mod1在腎臟樣品中含量很高，經(jīng)過超聲破碎的樣品有明顯的兩條帶;Es3位點(diǎn)顯色結(jié)果不清晰，沒有明顯的帶型，不能作為檢測項(xiàng)目;Trf為血清蛋白，雖然從肺、血清和溶血素樣品中都能分辨出條帶，但在血清中帶型最清晰，因此選擇血清作為檢測Trf的組織來源。

根據(jù)建立的生化基因位點(diǎn)檢測方法，對(duì)BWELSPF雞群和Line－22雞群K2家系進(jìn)行了多態(tài)性的初步檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BWEL－SPF雞群在Trf、Es1和Akp1存在帶型差異，Line－22雞群在Idh1、Mod1和Akp1存在差異，表明2個(gè)雞群的遺傳學(xué)背景都存在一定程度的多態(tài)性，這也符合封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳特點(diǎn)要求。

雖然本研究建立的生化標(biāo)記位點(diǎn)檢測方法對(duì)SPF雞群的遺傳結(jié)構(gòu)分析提供了一定依據(jù)，但由于該方法在敏感性和特異性上的不足，還難以對(duì)實(shí)驗(yàn)禽類進(jìn)行更精確的多態(tài)性分析。有關(guān)分子水平的遺傳學(xué)檢測方法的建立，將在后續(xù)研究中進(jìn)行報(bào)道。

(本文圖1～6見彩插12。)

［1］中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)哺乳類試驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制［GB］.國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.2001.8.29.

［2］Hashiguchi T，Tsuneyoshi M，Nishida T，et al.Phylogenetic relationships determined by the blood protein types of fow ls［J］.J Zootech Sci，1981，52(10):713－729.

［3］鄭曉鋒，劉文超.濱白雞三種血清酶同工酶遺傳特性及其育種應(yīng)用價(jià)值的研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，1995，9:12－15.

［4］馬力，劉曉剛.羅曼蛋雞血清蛋白多態(tài)性的研究［J］.西南民族學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998，24(1):51－53.

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［6］張永亮，簡承松，朱文適，等.貴州小香烏雞血漿同工酶的遺傳多態(tài)性［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2000，19(1):16－20.

［7］王民，張才駿.藍(lán)馬雞和藏馬雞的血清酯酶同工酶酶譜［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，23(12):3－4.

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Estab lishm ent of a M onitoring M ethod of Biochem ical M arkers in BW EL-SPF Chicken Popu lations

HAN Ling－xia1，GAO Peng－fei1，2，LIU Xiao－lei1，SI Chang－de1，QU Lian－dong1
(1.Laboratory Animal Center of Harbin Veterinary Research Institute，CAAS，Harbin 150001，China;
2.College of Animal Science and Technology，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801)

ObjectiveTo establish a detection method of biochemical markers for genetic monitoring of SPF chickens.M ethod According to national standard“Laboratory Animal－Genetic Monitoring:Methods for Biochemical Markers of Inbred Mice and Rats”，cellulose acetate membrane electrophoresis was used to develop the monitoring method..ResultsIt was showed that 7 types of isozymes could be used to monitor the chicken populations，hemoglobin β－chain (Hbb)should be tested in the hemolysin，transferrin(Trf)in the lung，carbonic anhydrase－2(Car2)in the liver or hemolysin，isocitrate dehydorgenase－1(Idh1)，malic enzyme－1(Mod1)and alkaline phosohatase(Akp1)in the kidney，and esterase－1(Es1)in the serum.Conlusions A genetically detection method of biochem ical markers for chickens has been established，and polymorphisms are identified in the BWEL－SPF chicken and Line－22－k2 chicken populations.

SPF chicken;Biochemical marker;Polymorphism;Cellulose acetate membrane electrophoresis

R－394

A

1005－4847(2010)02－0161－03

2009－07－13

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目(PC06S17);黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2007－06)。

韓凌霞(1971－)，女，博士，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究。Email:hlx1993@126.com