隱孢子蟲基因分型標記的研究進展*

王 強,安春霞,菅復(fù)春,朱靜靜,寧長申,張龍現(xiàn)

隱孢子蟲是一類寄生于包括人在內(nèi)的各類脊椎動物消化道上皮細胞的原生動物,常引起以胃腸炎和腹瀉為征的隱孢子蟲病,目前已有100多個國家發(fā)現(xiàn)并報道了該病〔1-2〕。1998年,世界衛(wèi)生組織(WHO)將人的隱孢子蟲病列為艾滋病(AIDS)懷疑指標之一。2003年,我國衛(wèi)生部門將其列為2個重要新發(fā)寄生蟲病之一。

迄今為止,隱孢子蟲有效種已達21個,基因型50多個〔3-7〕,而隱孢子蟲種和基因型的命名很大程度上仍依賴于來源宿主。自然條件下,同一蟲種或基因型常能感染多種動物,同類動物亦能感染不同蟲種或基因型,依據(jù)形態(tài)學(xué)、生活史和寄生宿主等很難加以區(qū)分。鑒于隱孢子蟲重要的公共衛(wèi)生意義,對寄生于人和畜禽體內(nèi)以及環(huán)境中隱孢子蟲卵囊進行精確檢測,并研究其宿主源和群體遺傳結(jié)構(gòu)尤為重要。近年來,分子標記已廣泛應(yīng)用于檢測和區(qū)分隱孢子蟲種、基因型和亞型,同時這些工具也用于隱孢子蟲傳播途徑的研究,這使得隱孢子的公共衛(wèi)生意義及人隱孢子蟲病傳染源得到更好界定,為控制隱孢子蟲病提供了有力的技術(shù)保障〔8-9〕。本文就近年來國內(nèi)外隱孢子蟲基因分型標記的研究進展綜述如下。

1 基因型分型工具

自1991年Laxer首次運用PCR技術(shù)檢測糞便樣品中隱孢子蟲以來,許多研究者均以PCR方法檢測臨床及環(huán)境樣本中的隱孢子蟲卵囊〔8〕。但分子生物學(xué)技術(shù)在隱孢子蟲病診斷中的廣泛應(yīng)用是在其用于基因分型之后才開始的。目前,常作為分子標記的基因位點主要有小亞基核糖體 rRNA(SSU rRNA)、70-kDa熱休克蛋白(HSP70)、卵囊壁蛋白(COWP)、肌動蛋白(actin)、乙酰輔酶A合成酶、二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-ts)、血小板反應(yīng)蛋白-相關(guān)黏附蛋白(PRAP-C1和PRAP-C2)等編碼基因、以及一些微衛(wèi)星序列(SSR-1)〔8-12〕。

1.1 18S rRNA基因 18S基因編碼小亞基核糖體RNA即18S rRNA,為5個拷貝重復(fù)序列,以連續(xù)排列方式存在于細胞內(nèi),長約1850bp,是唯一具有信息分子和功能分子兩種作用的 rRNA基因。隱孢子蟲18S基因具有高度保守性,易于PCR引物設(shè)計,幾乎能鑒別區(qū)分所有隱孢子蟲種類,是目前運用最廣的基因位點之一〔7〕。基于18S rRNA基因位點的分子流行病學(xué)工具通常用于人、動物和水樣中隱孢子蟲基因型的鑒定。許多特異性的 PCRRFLP技術(shù)都是基于18S rRNA基因進行的。早期隱孢子蟲種大都基于18S rRNA基因鑒定而命名,后來經(jīng)其他基因位點鑒定仍然成立〔13〕。近3年來,隱孢子蟲研究的116篇學(xué)術(shù)文章中有86%對18S rRNA基因進行了檢測,基于該基因中約830bp一片段進行限制性內(nèi)切酶消化的PCR-RFLP方法亦達70 篇論文〔7〕。2008年,Waldron 等〔14〕基于 18S rRNA建立的T-RFLP方法,通過產(chǎn)生的診斷性片段能夠特異、快速區(qū)分C.parvum和C.hominis。但18S rRNA基因的不足之處在于不同拷貝間存在微小的序列差異,這可能導(dǎo)致某一蟲種或基因型RFLP分析結(jié)果不一致,因此,區(qū)別不同分離株不同拷貝序列內(nèi)部差異是很有必要的〔3,9〕。

1.2 HSPs 熱休克蛋白家族(heat shock proteins,Hsps)是一群進化上高度保守的管家基因家族,根據(jù)其分子量不同將Hsps分為低分子量家族、中等分子量家族(如 Hsp65)、Hsp70家族、Hsp90家族和Hsp110家族,每個家族又有多個成員,其中Hsp70基因沒有內(nèi)含子且在進化上高度保守,一旦啟動轉(zhuǎn)錄即可產(chǎn)生成熟的 mRNA來快速表達Hsp70,在隱孢子蟲基因型檢測中應(yīng)用較廣。通過對該位點補充分析,已確立許多獨立種和基因型〔15〕。Glaberman 等〔16〕多位點分析 C.meleagridis,在 HSP70位點存在高度遺傳異質(zhì)性。同時,Hsp70也可用于隱孢子蟲亞型分析,通常用于C.meleagridis亞型分析。2009年,Feng等〔15〕運用Hsp90基因位點,成功地建立一套基因分型方法,該方法能準確區(qū)分感染人的隱孢子蟲種。

1.3 actin基因 肌動蛋白是真核細胞中普遍存在的高度保守的蛋白之一,其非編碼序列差異大,反映進化程度。2008年,Hill等〔17〕對澳大利亞負鼠新基因型BTP1分析,actin基因分析結(jié)果表明,其與C.f ayeri負鼠基因型Ⅰ和C.parvum同源性分別為86.5%和86.5%,這與 18S rRNA基因分析結(jié)果相一致,但對卵囊量較小的BT P2分析,Actin位點未能擴增出目的片段。因actin基因位點同一基因型內(nèi)變異小,從而限制其廣泛運用〔8〕。

1.4 cowp基因 Xiao等〔4〕在基因分型技術(shù)評價時,成功地運用Nest-PCR擴增出cowp基因中一長約550bp的片段區(qū)分 C.parvum不同基因型、C.muris和 C.serpentis。Pedraza-Dí az 等〔18〕從 2000份人樣本中分析了 cowp基因,確定所測樣本中的19名患者產(chǎn)生不常見的RFLP片段。隨后進行的DNA序列分析和其它4個基因位點分析,均確認這是和C.parvum在遺傳學(xué)上有明顯不同的種類,這一分離株鑒定為 C.meleagridis,其基因序列與從鳥類分離到的蟲體完全相同,其卵囊形態(tài)與 C.parvum 差異很大。Leoni等〔19〕在英國歷行 15年的流行病學(xué)調(diào)查研究中,發(fā)現(xiàn)2例C.andersoni,利用18S rRNA和 cowp基因的序列分析,均為 C.andersoni。由于其特異性差,基于cowp基因的分型工具應(yīng)用相對較少,近3年來,運用該位點的文獻僅占20%(23/116),且大多與18S rRNA基因結(jié)合運用〔7〕。但 cowp基因常用于新宿主C.parvum的鑒定〔7-8〕。

1.5 微管蛋白 β-微管蛋白(β-tubulin)基因微管是細胞骨架、紡錘體以及纖毛、鞭毛的主要組分,對細胞有支持作用。構(gòu)成微管的微管蛋白分子含兩個十分相似的亞基,即α-tubulin和β-tubulin。由于βtubulin基因既有保守的外顯子又有許多內(nèi)含子,已被用于原生動物的各級分類水平上的系統(tǒng)發(fā)育研究。Tanrivendi等〔20〕用β微管蛋白基因為靶序列,設(shè)計引物擴增(正向引物:ATGCTGTAATGGATGTAGT TAGACA;反向引物:GTCTGCAAAATACTATCTGG),同時用β微管蛋白中能區(qū)分出基因型Ⅰ和Ⅱ的49個堿基序列制成探針,并用免疫熒光標記物標記進行隱孢子蟲檢測。這種方法可特異地分辨出C.parvum基因Ⅰ型和Ⅱ型,且敏感性高,單卵囊即可檢出。為更好了解C.parvum不同分離株之間或分離株內(nèi)的異質(zhì)性程度,將微小隱孢子蟲β-tubulin的內(nèi)含子和鄰近的外顯子進行測序和RFLP分析,結(jié)果不同分離株檢測到不同等位基因,且在兩個完全不同的分離株中發(fā)現(xiàn)一個β-tubulin等位基因含有亞群重組的特征,說明了不同亞群之間有重組的趨勢〔7-8〕。

1.6 其他基因 在檢測C.parvum基因型方面,基于DHFR基因的多重等位基因特異性PCR(MAS-PCR)方法和 cowp基因PCR-RFLP與18s rRNA基因 巢氏 RFLP方法具有同樣的敏感性和特異性,并能檢測到多種基因型感染。基于CP2基因的qPCR方法能特異性檢測出C.parvum,該位點熱穩(wěn)定性好,對卵囊進行熱處理48h后仍能成功鑒定且檢測限為10個卵囊〔13〕。依據(jù)血小板反應(yīng)相關(guān)黏附蛋白(TRAP-C2)基因的369bp片段處電泳條帶,能將C.hominis與其他蟲種加以區(qū)分〔21〕。另外,TRAP蛋白(thrombospondin-related adhesive protein)、PNO(pyruvate:NADP+oridoreductase,PNO)基因和一些特異位點的核酸探針也都用于隱孢子蟲基因型的檢測〔12〕。

2 基因亞型分型標記

基因分型工具僅能從種和基因型水平上區(qū)分隱孢子蟲,隨著分子生物學(xué)研究發(fā)展,亞型分析工具越來越多地應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)研。基因亞型分型工具發(fā)展過程中主要使用以下遺傳性靶基因位點,包括微衛(wèi)星和小衛(wèi)星、60kDa糖蛋白(GP60)基因、雙鏈RNA成分(ds-RNA)和rRNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-2),這些目的基因比基因分型的基因位點進化率更高〔7-8〕。另外HSP70位點也可用于亞型分析。

2.1 GP60基因 GP60基因亞型彼此之間依據(jù)5'端編碼絲氨酸的三核苷酸(TCA、TCG或 TCT)重復(fù)數(shù)的差異加以區(qū)分。各亞型家族不同亞型依據(jù)命名系統(tǒng)區(qū)分〔9〕。GP60等位基因和蛋白序列多態(tài)性高,全部序列中每個等位基因位點可根據(jù)密碼子的重復(fù)數(shù)目不同而確定基因亞型〔22〕。GP60是隱孢子蟲基因組中最具多態(tài)性的標記基因,是應(yīng)用最廣泛的隱孢子蟲亞型靶基因。Sulaiman等〔21〕運用Nest-PCR方法檢測C.parvum的62個分離株發(fā)現(xiàn)在GP60位點產(chǎn)生9個不同的核苷酸序列,基因亞型等位基因主要為 Ⅱa和 Ⅱd,分別為28例和29例,對于生物種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究很有幫助。Strong等〔23〕基于 GP60基因的序列多態(tài)性,詳細描述了隱孢子蟲GP60基因的5個等位基因,其中一個包括所有C.parvum分離株(標記為Ⅱ),另外四個為C.hominis分離株(Ⅰa,Ⅰb,Ⅰc,Ⅰd)。Alves等〔24〕對葡萄牙的人和牛的隱孢子蟲GP60基因亞型分析后發(fā)現(xiàn) 7個等位基因,發(fā)現(xiàn)一個新的 C.parvum 等位基因 Ⅱd,且等位基因 Ⅱb和 Ⅱd,迄今只在葡萄牙有報道。Quilez J等〔25〕對西班牙山羊和綿羊羔隱孢子蟲GP60基因序列分析,新發(fā)現(xiàn)5個C.parvum亞型,且檢測出3個常見于人分離株的C.parvum亞型(IIdA17G1a,IIdA19G1,IIdA18G1),并指明在有限的區(qū)域內(nèi)C.parvum亦存在遺傳多樣性。GP60基因序列分析在 C.parvum人和牛基因型發(fā)現(xiàn)有近 100個GP60基因亞型,表明這項技術(shù)具有非常高的分辨力。遺憾的是GP60工具不能將C.parvum人和牛基因型清晰的分為兩個群,因此,需要分辨力更強的位點用于亞型分型技術(shù)以更準確研究隱孢子蟲亞型及其相關(guān)研究〔7〕。

2.2 微衛(wèi)星序列 串聯(lián)重復(fù)序列是指1-200個堿基左右的核心重復(fù)單位,以頭尾相串聯(lián)的方式重復(fù)多次所組成的序列。它廣泛存在于真核生物和一些原核生物基因組中,并表現(xiàn)出種屬特異性。在基因組整體水平上,不同種的優(yōu)勢重復(fù)序列類型不同,即使在同一重復(fù)序列內(nèi)部,不同重復(fù)拷貝類別(如AT、AC等)也表現(xiàn)出很大差異。同時,這些重復(fù)序列類型和各重復(fù)拷貝類別在同一物種的不同染色體間以及基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)間也表現(xiàn)種屬和堿基組成差異〔8〕。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星是DNA序列包括1-4個堿基對的串聯(lián)重復(fù)序列(微衛(wèi)星)或更多(小衛(wèi)星)。因為復(fù)制錯誤,這些序列進化速率普遍比其他核苷酸基因快。微衛(wèi)星和小衛(wèi)星的遺傳變異主要是指銜接重復(fù)的變化,因此通過PCR產(chǎn)物分級,使用傳統(tǒng)凝膠電泳或現(xiàn)代基因掃描方法均能分離鑒別亞型〔7〕。Strong 等〔23〕發(fā)現(xiàn) C.hominis 分離株的 4個等位基因,在每個等位基因內(nèi),根據(jù)多個三聯(lián)核苷酸串聯(lián)重復(fù)分為不同基因亞型。Caccio等〔26〕對94個分離株擴增微衛(wèi)星位點進行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn),C.parvum至少應(yīng)該有兩個遺傳群體且各遺傳群體內(nèi)部在串聯(lián)重復(fù)和點突變的位置不同,揭示了分離株地理分布差異和宿主特異性。因此,微衛(wèi)星位點分析對于隱孢子蟲流行病學(xué)、傳播途徑及種群結(jié)構(gòu)研究很有幫助。

2.3 ds-RNA和轉(zhuǎn)錄間隔子ITS ds-RNA和ITS-2的SSCP序列分析也用于C.parvum和C.hominis亞型分析,ds-RNA具有最高的分化能力,但其RT-PCR靈敏度低。由于其在染色體外,不能和蟲體共同進化,因此,其不能將C.parvum和C.hominis明確區(qū)分開來〔7-8〕。ITS 分為 ITS-1和ITS-2兩個區(qū)域,由于ITS區(qū)域既具有核苷酸序列的高度變異性又具長度上的保守性,種間變異率較種內(nèi)低,且ITS區(qū)域兩側(cè)翼編碼區(qū)易于通用引物設(shè)計,因此ITS區(qū)域已普遍用來分析近緣種和種群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。ITS-2(GenBank assession no.AF015774)含有5個拷貝數(shù)的高度變異區(qū)域最適合基因亞型分析〔7〕。Tiangtip等〔27〕對隱孢子蟲 MS2,MS3和MS4基因進行研究,其序列分析表明CR2和CR9分離株屬于C.meleagridis,它們有相同的ITS序列;而CR8屬于C.muris,ITS存在差異。

2.4 其他位點 在 C.homimis、C.parvum、C.meleagridis多位點分析(MLST)方面,6號染色體上 GP60、CP47、CP56、TSP8(ML2)、RPGR、Mucin1、CP56、MSC6-7、DZ-HRGP、ZPT 等位點 ,2 號染色體上 HSP70小衛(wèi)星位點等均具有較高特異性〔3,7-9〕。

3 工具酶

分子流行病學(xué)研究另一重要手段就是酶切鑒定,即DNA物理圖譜的制作。它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點組成,以直線或環(huán)狀圖式表示。當前,沒有推薦用于隱孢子蟲種類鑒定的標準遺傳位點,然而建立在酶切基礎(chǔ)之上的基于18S rRNA位點研究隱孢子蟲基因型或隱匿種的PCR-RFLP技術(shù)方法在目前研究中是一個優(yōu)勢〔7〕。構(gòu)建隱孢子蟲DNA限制性內(nèi)切酶圖譜通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶,通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置從而鑒定隱孢子蟲種〔8〕。目前,常用的 Ⅰ類酶主要有 SspI、VspI(AseI)、DdeI、DraI、RsaI、StyI、H phI、BbsI,Ⅱ類主要有 MboII〔15〕。其中運用最廣的為 VspI、SspI、DdeI、MboII。VspI用于主要用于區(qū)分C.parvum和C.homimis,SspI通常用于種類診斷。通過18S rRNA巢式PCR后經(jīng)SspI和VspI雙酶切消化能鑒定大多數(shù)隱孢子蟲和基因型,牛的樣品需要SspI和MboII雙酶切鑒定以區(qū)分C.parvum和C.bovis,DdeI用以區(qū)分 C.muris和 C.andersoni〔28〕。

4 展 望

分子生物學(xué)技術(shù)運用于隱孢子蟲的研究已極大地提高了人們對隱孢子蟲的認知水平,其與形態(tài)測定、宿主特異性、生物學(xué)特征研究等互補使得隱孢子蟲分類和種類鑒定更為科學(xué)、準確〔7,29〕。隱孢子蟲基因分型標記的發(fā)展,對于理解隱孢子蟲生物學(xué)及流行病學(xué)有著至關(guān)重要的作用,現(xiàn)在我們能從基因型和亞型水平上理解隱孢子蟲的傳播途徑、群體結(jié)構(gòu)和宿主相互作用機制〔30-31〕。第二代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查相結(jié)合有著無比廣闊的前景,新一代基因型和亞型工具在流行病學(xué)研究的廣泛運用必將使人們對人和動物的隱孢子蟲病有更深層次的理解。

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