河北省豬場腦心肌炎病毒感染的血清學調查*

劉蘭亞,陳春花,許玉靜,宋勤葉,李潭清

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于微 RNA病毒科、心病毒屬成員,其易感宿主廣泛,是多種脊椎動物和人類腦心肌炎的病原,可導致動物和人類發(fā)生腦炎、心肌炎或心肌周圍炎〔1-3〕。大鼠和小鼠是EMCV的自然宿主,家畜中以豬對EMCV的易感性最高,哺乳仔豬感染后出現急性致死性心肌炎,死亡率可達100%,妊娠母豬則以流產、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙為主要特征,其他豬多呈隱性感染狀態(tài)〔4-6〕。據報道豬腦心肌炎高發(fā)地區(qū),人 EMCV感染的病例也較高〔7〕。人類感染EMCV后出現發(fā)熱、頭痛、頸部僵硬、昏睡、譫語、嘔吐等癥狀,有學者從患腦膜炎和腦炎的兒童體內分離到EMCV,并從患者和其他正常人群血清中檢測到EMCV 抗體〔2-3,8〕。

豬腦心肌炎自1958年首次在巴拿馬報道并證明EMCV為其病原后,目前全球多個國家和地區(qū)有該病發(fā)生和流行的報道,但不同地區(qū)EMCV的抗體陽性率不同〔6,9,10-11〕。國內于2007年首次從病死仔豬或流產胎兒分離到EMCV,隨后證明了多個省區(qū)的豬場有EMCV感染存在,不同地區(qū)的抗體陽性率在39.64%～90%之間〔12-14〕。鑒于 EMCV 是一個重要的人獸共患病致病因子,因此,明確當地豬場EMCV感染的流行狀況,對減少豬場經濟損失和保證人類健康均具有重要意義。本文旨在對河北省不同豬場EMCV的感染情況進行血清學調查,以便為EMCV的有效防控提供流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 血清樣本 2006-2008年,從河北保定、滄州、承德、邯鄲、廊坊、衡水、唐山、秦皇島、石家莊、邢臺等10個地區(qū)的31個規(guī)模化豬場采集的不同生長階段豬的血清樣本,共計1 306份。

1.2 試劑 EMCV重組非結構蛋白2C與豬EMCV抗體陽性、陰性血清:河北農業(yè)大學動物傳染病實驗室制備并保存;小牛血清:購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司;HRP-羊抗豬 IgG:購自Solarbio公司。

1.3 EMCV抗體檢測 應用間接ELISA方法檢測血清抗體,包被抗原(EMCV重組蛋白2C)的制備與ELISA操作程序參見文獻〔15〕。ELISA的基本操作步驟如下:以1 μ g/mL的重組蛋白2C包被酶標板,于37℃孵育1 h后4℃作用過夜;PBST(含0.05%Tween-20的 0.01 mol/L pH7.4 PBS)洗板3次,3 min/次;每孔加入100μL封閉液(含5%犢牛血清的PBST)于37 ℃封閉1 h;棄去封閉液,每孔加入1︰20倍稀釋的待檢血清100μL于37℃下反應 1 h;洗板,方法同上;每孔加入 100μL 1 ︰400稀釋的酶標二抗,于37℃反應45 min;洗板,方法同上;每孔加入100μL底物(TMB),于室溫避光顯色 15 min,加入 50μL 2 mol/L H2SO4終止液 ,終止反應;用酶聯檢測儀測定OD450nm光吸收值。當被檢樣本的 OD450 nm值＞0.27時,判定為陽性;當OD450 nm值＜0.27時,判定為陰性。

2 結 果

2.1 河北省豬群腦心肌炎抗體的ELISA監(jiān)測結果被檢測的1 306份血清樣本中,腦心肌炎抗體的總陽性率為13.48%(176/1 306),調查的10個地區(qū)中6個為抗體陽性。抗體陽性地區(qū)的感染率不同(5%～26%)(表1)。上述結果表明,河北省60%(6/10)的地區(qū)已經存在豬EMCV感染現象,但不同地區(qū)的感染情況存在差異。

2.2 不同生長階段豬群EMCV抗體陽性率的比較依據EMCV抗體檢測結果,對569份EMCV抗體陽性血清與豬日齡的關系進行了分析,發(fā)現不同生長階段豬的EMCV抗體陽性率不同,其中經產母豬與后備母豬的抗體陽性率較高,分別為27.68%(31/112)和16.67%(5/30),仔豬與育成豬的抗體陽性率較低,分別為2.86%(5/175)和1.98%(5/252)(圖1)。該結果表明,帶毒母豬是豬群EMCV感染發(fā)生的主要原因之一。

表1 血清來源及EMCV抗體陽性率Table 1 Source of swine serum samples and positive rates of antibody to EMCV

圖1 不同生長階段豬群EMCV抗體陽性率Fig.1 Positive rates of antibodies to EMCV in pigs at different ages

3 討 論

EMCV廣泛流行于歐洲、美洲、亞洲等世界多個國家和地區(qū)〔6,9-11,14〕,不僅可以直接導致哺乳仔豬急性死亡和妊娠母豬繁殖障礙,而且能夠在成活豬群中呈隱性感染形式長期存在,給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經濟損失。同時,由于其易感宿主廣泛,可以跨種間傳播,尤其是能夠引起人類感染與發(fā)病〔2-3,7〕,已有實驗證明EMCV可以在人心肌細胞內增殖〔16〕,并且豬與人類關系密切,豬的組織器官是動物—人類間器官移植的首選對象。因此,開展豬EMCV感染的流行病學調查對豬腦心肌炎的有效防治與保證人類健康具有重要實踐意義。豬腦心肌炎流行病學調查常用的血清學方法為血清中和試驗(SNT),但SNT操作繁瑣、費用較高,不適合進行大規(guī)模樣本檢測,在一定程度上影響和限制了豬腦心肌炎流行病學調查資料的廣泛獲取和臨床診斷。先前研究〔15〕已證實基于EMCV重組非結構蛋白2C的間接ELISA與SNT的符合率為96%,特異性高,不與感染豬的常見病原如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒等的抗體發(fā)生交叉反應,可以取代SNT用于EMCV感染的早期診斷與血清流行病學調查。所以本研究中采用了基于EMCV重組非結構蛋白2C作為包被抗原的間接ELISA方法檢測EMCV抗體。

對2006-2008年間河北省10個地區(qū)31個豬場的1 306份血清樣本的檢測結果顯示,EMCV抗體總陽性率為13.48%,高于法國(2006)和韓國(2009)豬群EMCV抗體的監(jiān)測結果(2.48%和9.1%)〔11,17〕,但低于張家龍等(2007)〔14〕報道 的2005-2006年間河北部分豬場的EMCV抗體陽性率85.04%,這可能與血清來源和采集時間不同有關,因為一種疫病在不同地區(qū)或豬場、同一地區(qū)不同時期的感染與流行情況常存在明顯差異。在被調查的10個地區(qū)中6個檢測到了相應的抗體,4個為抗體陰性,表明河北省大多數地區(qū)已經存在EMCV感染現象,但不同地區(qū)豬場EMCV的感染率不同(5%～26%)。此結果提示,有關部門應重視豬腦心肌炎的防控,以免其進一步擴散與流行,甚至引發(fā)公共衛(wèi)生事件。

進一步對不同飼養(yǎng)階段豬的EMCV抗體陽性率的分析結果表明,經產母豬和后備母豬的抗體陽性率(27.68%和16.67%)明顯高于仔豬和育成豬(2.86%和1.98%),該結果與文獻〔9〕報道的美國依俄華州成年母豬和后備母豬的抗體陽性率(17.2%)高于育成豬(12.2%)的分布趨勢類似。同樣,國內2005-2006年間豬群EMCV感染的血清學調查結果也表明母豬的抗體陽性率(96.39%)高于其他生長階段豬的抗體陽性率〔14〕。綜合上述不同國家(地區(qū))或時期豬EMCV感染的血清學調查結果,充分說明種母豬在EMCV的傳播與流行中占有重要地位,并提示在豬繁殖障礙疫病中EMCV的作用不容忽視,因此需要進一步加強豬群繁殖障礙類疫病的病原學研究,明確EMCV的危害,為制定有效防控措施提供科學依據。

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