肺炎鏈球菌耐藥性檢測(cè)及其對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制的研究*

潘方平,吳璐怡,葉云飛,孫愛華

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是人類細(xì)菌性肺炎的主要病原體,也可引起腦膜炎、敗血癥的中耳炎等疾病〔1〕。近年來,許多國家和地區(qū)對(duì)β-內(nèi)酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌菌株流行日益廣泛,導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)病率逐年升高〔2-4〕,我國也不例外〔5-6〕。與 β-內(nèi)酰胺類抗生素不同,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不易引起過敏反應(yīng),因而在臨床上使用日趨增加,導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌株普遍流行且具有明顯的地區(qū)差異〔2,5〕。有文獻(xiàn)報(bào)道,肺炎鏈球?qū)Υ蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制主要涉及ermB和mef E基因〔7-8〕。因此,調(diào)查我國不同地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌流行狀況及其ermB和mefE基因相關(guān)耐藥機(jī)制具有重要意義。

本研究中,我們收集了浙江省各個(gè)地區(qū)臨床分離的138株肺炎鏈球菌,采用藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)了上述菌株對(duì)9種臨床常用抗生素的耐藥性,采用PCR檢測(cè)了上述菌株中ermB和mef A基因分布,以初步了解本地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性肺炎鏈球菌的流行情況及其主要耐藥模式。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 138株肺炎鏈球菌臨床菌株分離自2006年至2009年浙江省不同地區(qū)病人臨床標(biāo)本并經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株肺炎鏈球菌ATCC49619購自衛(wèi)生部臨檢中心,金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌DH5α株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供。肺炎鏈球菌接種于含5%脫纖維羊血的MH瓊脂平板上,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng);金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌接種于MH瓊脂平板上37℃培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 各抗生素E-test條或紙片分別購自瑞典AB-BioDisk公司及杭州天和微生物制劑有限公司。MH瓊脂購自英國Oxoid公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海博彩生物科技有限公司(BioColor)。PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和T-A克隆試劑盒購自大連寶生物有限公司(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA模板制備 將新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物3 000 r/min離心,取沉淀的菌體用0.01mol/L、pH7.4的磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌、離心3次后取沉淀。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(BioColor)說明書,提取各菌株基因組DNA。提取的DNA溶于T ris-HCl-EDTA(TE)緩沖液中,采用紫外分光光度法測(cè)定DNA濃度和純度〔9〕。

1.2.2 PCR 參考GenBank中登錄的ermB基因(accession No.:AJ243540)和 mefE基因(accession No.:AF274302)序列及相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物〔10-11〕。擴(kuò)增ermB 基因片段(1114～ 1851 bp)引物序列:上游5'-GAA AAA GTA CTC AAC CAA ATA-3',下游 5'-AGT AAC GGT ACT TAA ATT GT T-3'。擴(kuò)增mefE基因片段(1741～2006 bp)引物序列:上游5'-agg gag atg aaa gaa gga-3',下游5'-ATA AAA TGG CAC CGA AAG CCC-3'。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成。PCR總體積為100μL,內(nèi)含2.5 mol/L各 dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Taq-Pfu酶(TaKaRa)、100 ng DNA模板和 1×PCR緩沖液(pH8.3)。PCR參數(shù):94℃5 min;94℃30s、54℃30s、72℃45s(mefE基因片段)或60s(ermB基因片段),35個(gè)循環(huán);72℃7 min。采用溴乙錠預(yù)染的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,ermB和mef E基因片段目的擴(kuò)增片段預(yù)期大小分別為639 bp和366 bp。

1.2.3 目的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和測(cè)序 為了核實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa)提取部分陽性目的擴(kuò)增片段。按T-A克隆試劑盒(TaKaRa)說明書,將提取ermB和mef E基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中,形成重組質(zhì)粒 pMD18-TermB和 pMD18-TmefE,轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α中擴(kuò)增后,采用小量堿變性法提取重組質(zhì)粒〔9〕,委托上海Invitrogen公司測(cè)序。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法和E-test檢測(cè)138肺炎鏈球菌臨床菌株對(duì)9種抗生素的敏感性。E-test法嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作和判讀結(jié)果,K-B紙片法參照NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果〔12〕。實(shí)驗(yàn)中分別采用肺炎鏈球菌ATCC49619、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌ATCC25922株進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SSPS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)ermB和mef E基因檢測(cè)陽性率及耐藥率進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 ermB和mef E基因PCR檢測(cè)結(jié)果 肺炎鏈球菌臨床菌株的ermB和mef E基因PCR檢測(cè)效果見圖1和圖2。138株肺炎鏈球菌菌株中,91.3%(126/138)檢出ermB基因,33.3%(46/138)檢出mef E基因,其中38株ermB和mef E基因檢測(cè)結(jié)果均陽性,ermB基因攜帶率(91.3%)明顯高于mef E基因(33.3%)(P＜0.05)。

2.2 ermB和mef E基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 9株肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mefE基因片段PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見圖3和圖4。與GenBank中ermB基因(accession No.:AJ243540)和mef E基因(accession No.:AF274302)序列比較,除引物序列外上述肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因片段核苷酸序列相似性分別為99.16%～100%和99.08%～100%。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,對(duì)紅霉素耐藥率高達(dá)93.5%(129/138),對(duì)青霉素、喹奴普達(dá)/達(dá)福普汀的氯霉素和耐藥率為18.8%～42.0%,但對(duì)頭孢噻肟、頭孢呋辛、阿莫西林和左氧氟沙星的耐藥率較低(2.9%～4.3%),未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素菌株(表1)。

2.4 ermB和mef E基因與紅霉素耐藥性關(guān)系138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,無ermB及mef E基因的所有4株菌株、2株僅含ermB基因和2株僅含mef E基因菌株對(duì)紅霉素敏感,其余菌株均對(duì)紅霉素耐藥(表2)。

3 討 論

青霉素是治療革蘭陽性肺炎鏈球菌感染性疾病的首選藥物。由于青霉素可導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物過敏反應(yīng),作為大環(huán)內(nèi)酯類代表性抗生素的紅霉素,被廣泛用于肺炎鏈球菌感染相關(guān)疾病。隨著青霉素和紅霉素的廣泛應(yīng)用,臨床上相關(guān)耐藥肺炎鏈球菌菌株的分離率逐年升高〔2-6〕。在亞洲地區(qū),肺炎鏈球菌臨床菌株對(duì)紅霉素耐藥現(xiàn)象尤其嚴(yán)重〔4〕,我國重慶、上海和青島等地近年報(bào)道的肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥率高達(dá)96.0%～100%〔5-6〕。本研究中,浙江地區(qū)分離的138株肺炎鏈球菌臨床菌株對(duì)紅霉素耐藥率也高達(dá)93.5%(129/138),但對(duì)青霉素耐藥率也為18.8%,對(duì)阿莫西林、頭孢噻肟和頭孢呋辛耐藥率分別僅為2.9%、2.9%和4.3%,提示紅霉素已不適合作為肺炎鏈球菌感染性疾病的臨床藥物,β-內(nèi)酰胺類及頭孢菌素類可作為臨床上治療肺炎鏈球菌感染性疾病的一線藥物。

表1 138株肺炎鏈球菌臨床菌株對(duì)10種抗菌藥物的耐藥率Table 1 Drug resistant ratios against 10 antibacterial drugs of 138 S.pneumoniae isolates

表2 ermB和mefE基因與紅霉素耐藥相關(guān)性Table 2 Correlation among ermB/mef E genes and erythromycin/clindamycin

肺炎鏈球菌ermB基因編碼紅霉素耐藥相關(guān)核糖體甲基化酶,該基因通常定位在細(xì)菌染色體上,其轉(zhuǎn)座也通常發(fā)生在染色體與染色體之間,在核糖體甲基化酶作用下,細(xì)菌23 SrRNA第25位腺嘌呤殘基N-6位甲基化,降低了細(xì)菌核糖體與紅霉素的結(jié)合力,可介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)所有大環(huán)內(nèi)酯類的高水平耐藥〔10〕。肺炎鏈球菌mef E基因是細(xì)菌主動(dòng)外排基因操縱子元件,編碼一種能量依賴的膜藥物外排泵蛋白,可將14、15元環(huán)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素泵出細(xì)菌細(xì)胞外,使細(xì)菌產(chǎn)生低水平耐藥性〔10-11〕。為了解本地區(qū)肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因攜帶率,我們采用PCR對(duì)上述菌株兩種目的基因進(jìn)行了檢測(cè),測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增產(chǎn)物確為ermB或mef E基因,99.08%～100%序列相似性提示該兩個(gè)基因序列極為保守。PCR結(jié)果顯示,138株肺炎鏈球菌臨床菌株中,ermB基因攜帶率很高(91.3%),mef E基因攜帶率較低(33.3%),27.5%菌株(38/138)同時(shí)攜帶上述兩種基因,表明ermB基因是本地區(qū)肺炎鏈球菌臨床菌株紅霉素耐藥相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因(P＜0.05)。

肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥機(jī)制在不同國家和地區(qū)頗有差異。在歐洲和亞洲,肺炎鏈球菌對(duì)紅霉素耐藥性主要由ermB基因表達(dá)產(chǎn)物介導(dǎo)〔5-6,13-15〕;在美國和加拿大,攜帶mef E基因的肺炎鏈球菌菌株對(duì)紅霉素耐藥更為常見〔7-8〕。本研究中138株肺炎鏈球菌臨床菌株ermB和mef E基因攜帶狀態(tài)與紅霉素耐藥相關(guān)性分析結(jié)果顯示,不攜帶上述兩種基因菌株均對(duì)紅霉素敏感,僅攜帶mef E基因菌株對(duì)紅霉素耐藥率(62.5%)明顯低于同時(shí)攜帶兩種基因菌株耐藥率(100%)及僅攜帶ermB基因菌株耐藥率(97.7%)(P＜0.05),提示ermB和mef E基因不僅確與肺炎鏈球菌紅霉素耐藥密切相關(guān),且ermB基因可使細(xì)菌產(chǎn)生較mef E基因更強(qiáng)的紅霉素耐藥性。

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