尼可剎米對新生大鼠大腦皮層神經元鈉通道的興奮作用

千智斌,宋曉榮,姬明麗

(河南省新鄉醫學院:1.機能學實驗室;2.病理生理學教研室 453003)

尼可剎米對新生大鼠大腦皮層神經元鈉通道的興奮作用

千智斌1,宋曉榮2,姬明麗2

(河南省新鄉醫學院:1.機能學實驗室;2.病理生理學教研室 453003)

目的觀察尼可剎米對新生大鼠皮層神經元電壓依賴性鈉通道的作用。方法應用全細胞膜片鉗技術觀察尼可剎米對新生大鼠腦片皮層神經元電壓依賴性鈉電流的作用。結果尼可剎米增加皮層神經元河豚毒素(TTX)敏感性電壓依賴鈉電流;尼可剎米使鈉通道穩態激活曲線向超極化方向移動,鈉通道半數激活電壓(V1/2)從給予尼可剎米前的(-34.67±3.07)mV變為給予尼可剎米后的(-37.63±3.37)mV(n=10,P＜0.05);尼可剎米使鈉通道的穩態失活曲線向去極化方向移動,鈉通道半數失活電壓(V1/2)從給予尼可剎米前的(-43.36±3.06)mV變為給予尼可剎米后的(-33.24±2.05)mV(n=10,P＜0.01)。結論尼可剎米通過改變皮層神經元鈉通道的動力學特征來增加電壓依賴性鈉電流,這可能是尼可剎米興奮中樞神經元的作用機制之一。

尼可剎米;皮層神經元;全細胞膜片鉗;鈉通道

電壓依賴性鈉通道在細胞動作電位產生和傳播過程中起著十分重要的作用,是快反應細胞的功能基礎[1]。許多資料表明,鈉通道結構和功能的改變與神經元正常功能和多種疾病密切相關[2-3]。大腦皮層是運動、感覺、意識、情緒、語言、學習和記憶的高級中樞,大腦皮層結構和功能的正常是個體健康存活的前提。尼可剎米是臨床治療上常用的非特異性呼吸中樞興奮劑,臨床上過量使用尼可剎米引起中樞興奮、精神錯亂、惡心、嘔吐、抽搐、血壓升高、心律失常、驚厥等不良反應。為明確尼可剎米對新生大鼠皮層神經元鈉通道的作用機制,分析尼可剎米對皮層神經元功能的影響,本研究使用新生大鼠全腦腦片,應用全細胞膜片鉗技術觀察尼可剎米對皮層神經元鈉通道的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley大鼠10只,日齡1～3 d,雌雄不限,由南方醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑 CsCl、TEACl、CaCl2、EGTA、MgCl2、Na2ATP 、HEPES購自Sigma公司,河豚毒素(T TX)購自河北水產研究所,其余為國產分析純。人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF,in mmol/L):NaCl 124 mmol/L,KCl 5 mmol/L,MgSO41.3 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,NaHCO326 mmol/L,葡萄糖30 mmol/L。電極內液 (microelectrode internal solution,MIS,in mmol/L):CsCl 110 mmol/L,TEACl 30 mmol/L,CaCl21 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Na2ATP 4 mmol/L,HEPES 10 μ mol/L,用CsOH調節pH值至7.2,-20℃保存。

1.3 大鼠海馬腦片標本制備 新生大鼠乙醚麻醉后斷頭取腦、腦修切立即固定于震動切片機(LEICA VT1000S德國)的切片槽內,內盛0℃ACSF并持續通95%O2和5%CO2混合氣,該操作在1 min內完成。利用震動切片機冠狀切取厚400 μ m包含完整海馬的腦片,將腦片轉移至持續通 95%O2和 5%CO2混合氣的孵育槽中,34℃孵育30 min后常溫孵育。記錄時將腦片轉移至記錄槽中并使用粘有尼龍絲的白金框固定腦片。保持溫度在 27～29℃,記錄槽容積8 mL,記錄槽中ACSF使用蠕動泵循環,流速為6～8 mL/min。

1.4 全細胞膜片鉗記錄 在紅外微分干涉相差顯微鏡(600-FN,NIKON,日本)下選擇內錐體細胞層(internal pyramidal layer)邊緣清晰、立體感強、胞質均勻、軸突樹突較長的神經元進行全細胞膜片鉗記錄(n=10)。記錄電極外徑1.5 mm(南京六合泉水教學實驗器材有限公司,中國),使用微電極拉制儀(P-97,Sutter,美國)多步水平拉制而成,并使用拋光儀(MF-830,NARISHIGE,日本)拋光。電極尖端內徑2～ 3 μ m,充灌內液電極后加少許正壓后阻抗為2～4 MΩ。在顯微鏡下操縱微電極接近神經元,當電極電阻升高0.1 M Ω或觀察到神經元細胞膜被電極尖端正壓“沖”出痕跡時,立即撤去正壓并給少許負壓,封接電阻急劇上升,當封接電阻上升至1 GΩ以上時,微電極與細胞膜之間即形成了穩定的高阻封接。這時進行快電容補償(C-fast),稍加負壓或電擊破膜,形成全細胞模式,后行慢電容補償(C-slow),并通過漏電流法減去漏電流(leak substraction)。在設定的刺激電壓模式下記錄引出的電流。全細胞膜片鉗記錄所用放大器為MultiClamp700B膜片鉗放大器(AXON,美國),使用Pclamp10.0軟件描記實驗曲線和處理結果。

1.5 實驗分組 以正常ACSF灌流所記錄到的數據為正常組,含尼可剎米的ACSF灌流記錄到的數據為尼可剎米組。

1.6 統計學方法 實驗數據以x±s表示,使用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析檢驗和配對t檢驗,Origin7.5軟件作圖,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 尼可剎米對皮層神經元電壓依賴性鈉電流的影響 鉗制膜電位于-80 mV,給予-80～+20 mV的階梯去極化脈沖步幅10 mV,步寬12 ms,記錄到電壓門控內向電流。該電流在大約-50 mV時出現、-20mV時達到峰值,符合鈉通道的動力學特征,并可被外液中加入的1 μ mol/L TTX阻斷,確定所記錄到的是鈉電流。記錄到空白ACSF下的鈉電流后,經蠕動泵灌流含5 mg/L尼可剎米的ACSF[4],10 min后再次記錄鈉電流。比較使用尼可剎米前后鈉電流的變化,分析尼可剎米對皮層神經元鈉電流的作用。以測試電壓為橫軸、相應電壓下鈉電流幅值為縱軸繪制出給藥前后I-V曲線,將各細胞給藥前后各測試電壓下最大激活電流進行統計分析。結果發現,尼可剎米在膜電位-50～+20 mV范圍內增大鈉電流。(n=10,單因素方差分析:F=195.458,P=0.000,圖1A尼可剎米對神經元鈉電流原始圖,圖1B尼可剎米對神經元鈉電流I-V曲線圖)。

圖1 尼可剎米對皮層神經元鈉電流(圖1A)和鈉通道I-V曲線(圖1B)的作用。

2.2 尼可剎米對皮層神經元電壓依賴性鈉通道激活曲線和失活曲線的影響

2.2.1 尼可剎米對皮層神經元電壓依賴性鈉通道激活曲線的影響 鉗制膜電位于-70 mV,首先給予-130 mV、寬 500 ms的超極化脈沖,然后從-70 mV起給予10 mV步幅遞增、12 ms步寬的去極化脈沖刺激至0 mV,誘發鈉電流。以測試電壓為橫軸,測試電壓下的I/Imax為縱軸,用Boltzmann方程I/Imax=I/{1+exp〔(V-V1/2)/κ〕}進行曲線擬合。其中 V1/2為半數激活電壓。繪制給藥前后的穩態激活曲線。給藥前鈉通道激活曲線 V1/2為(-34.67±3.07)mV,給予尼可剎米后V1/2變為(-37.63±3.37)mV(n=10,P＜0.05)。激活曲線在尼可剎米加入后向超級化方向移動(圖2A),表明 5 μ g/mL的尼可剎米使鈉通道激活門開放閾值降低。

2.2.2 尼可剎米對皮層神經元電壓依賴性鈉通道穩態失活曲線的影響 鉗制膜電位于-100 mV,給予-120～+10 mV、寬500 ms(足夠長的時間來獲得穩態失活),階躍10 mV的系列條件脈沖刺激,條件脈沖后給予固定去極化至-20 mV、步寬12 ms的測試脈沖。以測試脈沖所激活的電流相對值I/Imax對條件脈沖電壓作圖,用Boltzmann方程I/Imax=I/{1+exp〔(V-V1/2)/κ〕}進行曲線擬合,得出鈉通道的穩態失活曲線(圖2B)。給藥前鈉通道失活曲線V1/2為(-43.36±3.06)mV,給予尼可剎米后V1/2為(-33.24±2.05)mV(n=10,P＜0.01)。尼可剎米使鈉通道穩態失活曲線向去極化方向移動,即鈉通道失活門關閉閾值升高。

圖2 尼可剎米對皮層神經元鈉通道激活曲線(A)和失活曲線(B)的作用

3 討 論

尼可剎米在臨床上被應用于以下3個方面:(1)呼吸中樞興奮劑[5],可選擇性興奮延髓呼吸中樞;(2)降低肝臟轉氨酶和黃疸,常用來治療新生兒黃疸[6-7];(3)作為溶解性較差藥物的促溶劑,促進藥物的溶解和在體內的吸收、釋放[8-9]。許多資料表明,鈉通道結構和功能的改變與神經元正常功能和多種疾病密切相關。鈉離子通道是神經元電活動的基本通道,是產生動作電位和長時程增強(long term potentiation,LTP)的基礎。鈉電流幅度影響著神經元的興奮性和動作電位幅度[10-11]。本研究實驗結果顯示,尼可剎米使皮層神經元鈉通道激活曲線向超極化方向移動,通道激活門開放閾值變負,通道激活門易開放;通道失活曲線向去極化方向移動,通道失活門關閉電位升高,通道失活門不易關閉。尼可剎米通過改變鈉通道動力學特征增加了皮層神經元鈉電流。實驗結果提示,尼可剎米對皮層神經元有興奮作用,這可能是尼可剎米興奮中樞神經系統(包括延髓呼吸中樞)的細胞機制之一。

Bushma等[12]發現尼可剎米用于降低肝臟轉氨酶時可增加還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、谷胱甘肽、尿苷二磷酸葡糖醛酸的生物轉化作用。尼可剎米進入體內后去乙基轉化為尼克酰胺,然后再被甲基化成為N-甲基尼克酰胺經腎臟排出。維生素PP包括尼克酰胺和尼克酸兩種形式(兩種形式在體內可以互相轉化),尼克酸、核酸、磷酸、腺嘌呤經酶促反應組成脫氫酶的輔酶NAD+和NADP+[13]。作者推測尼可剎米對海馬神經元的作用通過經典PKC途徑在NADPH位點存在交互作用。尼可剎米增加NADPH激活PKC、活性氧族(ROS)增加鈉電流,增加呼吸中樞神經元興奮性來發揮呼吸興奮劑作用。臨床上過量使用尼可剎米引起中樞興奮、精神錯亂、惡心、嘔吐、抽搐、血壓升高、心律失常、驚厥等不良反應,這些癥狀與鈉通道不能正常關閉導致組織細胞興奮性增高的鈉通道變異疾病表現相似[14],也間接提示尼可剎米的作用與呼吸神經元細胞膜鈉電流有關,為作者的實驗提供了佐證。Na+內流被認為是缺血性腦損害的始動因素之一。在缺血缺氧條件下神經元能量代謝障礙、胞內ATP減少使Na+-K+泵活性降低,膜靜息電位朝去極化方向變化。神經元膜電位去極化促使鈉通道開放增加,進一步增加胞內鈉濃度。胞內鈉濃度升高除了引起神經元水腫外還直接或間接引起鈣超載和以一些興奮性遞質釋放,從而加重神經元的缺血缺氧性損傷。臨床上治療缺血性腦損傷常采用低溫、高壓氧、改善微循環、增加神經元抗缺氧能力等措施。低溫降低神經元代謝率、減少ATP的消耗,同時也降低了鈉通道活性,降低了細胞鈉濃度,有利于神經元正常功能的恢復[15]。高壓氧治療提高了動脈血氧分壓,有利于神經元攝取足夠的氧以恢復正常功能[16]。本實驗從尼可剎米對鈉電流的作用方面,探討了尼可剎米興奮中樞神經系統的作用機制,根據尼可剎米對鈉電流的興奮作用為尼可剎米的臨床使用提供了實驗依據和指導意見。

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Roles of nikethamide on sodium channel of cortical neurons in neonatal rat brain slice

QI AN Zhi-bin1,SONG Xiao-rong2,J I Ming-li2
(1.Department of Functional Lab;2.Department of Pathophysiology,Xinxiang Medical University,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo explore the effects of nikethamide on sodium channel in cortical neurons of brain slice in neonatal rat.MethodsUsing the whole-cell patch-clamp technique to record sodium currents of cortical neurons of brain slice in neonatal rat.ResultsThe tetrodotoxin-sensitive voltage-dependent sodium currents in cortical neurons were increased by nikethamide.After nikethamide application,a clear shift of the activation curve of Na+channel was shown towards more hyperpolarized potential,resulting in channel opening at more negative membrane potentials.In the presence of nikethamide,the voltage for half-activation(V1/2)was(-37.63±3.37)mV compared with the control of(-34.67±3.07)mV(n=10,P＜0.05).The curve of steadystate inactivation of Na+channel was shifted towards positive potential after treatment of nikethamide.In the presence of nikethamide,V1/2 was(-33.24±2.05)mV compared with the control of(-43.36±3.06)mV(n=10,P＜0.01).ConclusionNikethamide alters the sodium channel kinetics and increases the voltage-dependent sodium currents.This might be the reason that nikethamide increases the excitability of neurons.

nikethamide;cortical neuron;whole-cell patch-clamp;sodium channel

R971.7;R965

A

1671-8348(2010)09-1053-03

2009-08-17

2009-10-19)

?論 著?