美托洛爾對異丙基腎上腺素誘導心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

趙智明,郭 寒,焦東東,陸 樂,蔡 輝

(南京軍區南京總醫院中西醫結合科,南京 210002)

美托洛爾對異丙基腎上腺素誘導心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響

趙智明,郭 寒,焦東東,陸 樂,蔡 輝

(南京軍區南京總醫院中西醫結合科,南京 210002)

目的探討美托洛爾對充血性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法實驗選用清潔級雄性SD大鼠60只,隨機分為空白組(n=15),模型組(n=45)皮下注射異丙基腎上腺素2次(170 mg/kg),6周后應用超聲心動圖檢測,以左室射血分數(LVEF)小于或等于45%確定造模成功,將心力衰竭大鼠模型隨機分為對照組(n=13)、美托洛爾治療組(n=14)8 mg?kg-1?d-1,18周使用左心導管進行血流動力學檢查,并利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA斷片化和免疫印跡分析法檢測Bcl-2、Bax、caspase-9和caspase-3的表達。結果(1)與空白組相比,對照組血流動力學指標明顯惡化,心室質量指數(VWI)、左心室質量指數(LVWI)顯著升高,心肌細胞凋亡率增加;(2)與對照組比較,美托洛爾組心率(HR)、左心室舒張末壓力(LVEDP)、VWI及LVWI明顯降低(P＜0.05)和±dp/dtmax明顯升高(P＜0.05),左心室重量指數明顯降低(P＜0.05),心肌細胞凋亡率下降。結論

美托洛爾能抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡,改善心功能,逆轉心室重構。

美托洛爾;充血性心力衰竭;SD大鼠;異丙基腎上腺素;心肌細胞凋亡

充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)是各種心血管疾病的共同轉歸,嚴重威脅著人類的健康。在心力衰竭(心衰)發生過程中,心肌細胞凋亡可能起了重要作用。本研究以心衰大鼠為實驗模型,觀察美托洛爾對心肌細胞凋亡的影響,并探討其意義,從而為臨床防治心衰提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與試劑 9周齡清潔級雄性SD大鼠(體質量230～280 g),購于南京中醫藥大學動物中心。藥品:美托洛爾(AstraZeneca,批號:0604045);鹽酸異丙基腎上腺素(ISO)購自美國SIGMA公司(批號:I5627)。RPMI 1640培養基(Life Technologies,Grand Island,NY),New bovine serum(NBS,杭州四季青),dithiothreitol(DTT,Sigma),Mouse anti-Bcl-2 monoclonal antibody,mouse anti-Bax monoclonal antibody and anti--tubulin(購自 Santa Cruz Biotechnology公司);Cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 antibody購自 Cell Signaling Technology公司。

1.2 實驗方法及分組 模型組45只,皮下注射ISO 0.25 mL(170 mg/kg,分2次,間隔24 h);正常組15只,皮下注射生理鹽水0.25 mL[1]。飼養環境(22±2)℃,常規飼料喂養,自由飲水。于實驗第6周應用彩色超聲監測儀(型號:HPsonos 5500,探頭頻率7.5 MHz,產地:美國)測量左室射血分數(LEVF)。測定值為5個心動周期的均值。以LVEF≤45%為造模成功(n=41)[2]。將造模成功大鼠隨機分為心衰對照組(NS 0.1 mL?kg-1?d-1灌胃,n=13)和美托洛爾組(metoprolol 8 mg?kg-1? d-1灌胃,n=14),飼養 18周,觀察大鼠的飲食、毛色、活動、發紺、水腫等一般性狀,每周稱體質量(BW)。

表1 2組大鼠血流動力學結果(±s)

表1 2組大鼠血流動力學結果(±s)

*:與正常組比較,P＜0.05;#:與心衰對照組比較,P＜0.05。

組別 n HR LVEDP LVSP dp/dtmax -dp/dtmax正常組 15 400.5±13.3 1.2±0.6 120.2±2.3 3.82±0.05 -3.61±0.02心衰對照組 13 453.3±10.8* 11.1±0.6* 104.8±1.7 2.33±0.05* -1.90±0.07*美托洛爾組 14 347.5±9.9*# 5.4±0.3*# 100.1±1.5 3.37±0.04*# -2.84±0.04*#

1.3 血流動力學檢測 18周實驗結束,將大鼠以戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后,應用左心導管插入左心室,通過壓力換能器輸入BL-410生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司),由實驗系統軟件處理獲得左心室舒張末壓力(LVEDP)、左心室內壓峰值(LVSP)、左心室壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)心率(HR)。

1.4 心臟質量指數測量 血流動力學檢測完畢后迅速打開胸腔摘取心臟,肉眼觀察后,剪去周圍大血管,在冰生理鹽水中洗凈血液,濾紙吸干,沿房室交界處去除左右心房,用電子天平(精確度0.000 1 g)稱取心室質量(VW),再剪去右心室游離壁,保留左心室及室間隔,稱取左心室質量(LVW),分別計算:心室質量指數 VWI(VW/BW)、左心室質量指數 LVWI(LVW/BW)。稱完后在乳頭肌水平下方室間隔及左室游離壁分別取全層心肌組織4～6塊(備用)。

1.5 心臟病理評分 所有標本于10%甲醛中固定24 h(4℃),常規取材、脫水、石蠟包埋,沿左室長軸線每隔 1 mm橫斷面切取5張(層厚4 μ m)切片,切片經 HE染色,Masson三色染色。光學顯微鏡下觀察:(1)心肌纖維有無肥大、變性、壞死;(2)間質有無充血、水腫、炎細胞浸潤、結締組織增生;(3)心內膜和心外膜有無充血、水腫、炎細胞浸潤。各種病變由輕到重的程度分別評分為1、2、3、4分,無病變為0分[3],累加每組每只動物所有分數,并進行統計學處理。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳測定DNA斷片化 將所取心肌組織勻漿,蛋白裂解,進行 DNA沉淀溶解后,在含有5 μ g/mL EB的1%agrose凝膠上電泳1 h后,用 UVP成像系統進行拍照。電泳過程中用DNA maker指示DNA片段。

1.7 免疫印跡分析(Western blot analysis) 取冰凍心肌組織融化勻漿,蛋白裂解,離心,取上清液。蛋白定量用BCA蛋白定量試劑盒(Pierce)進行測定,具體定量方法見試劑盒的說明書。不同分子質量的蛋白樣品經7.5%～15%的SDS-PAGE電泳分離,用半干法轉至PVDF(Millipore,USA)。轉移完后膜用麗春紅S(0.5%ponceaus S in 1%acetic acid)染色,洗滌,與化學發光底物(LumiGLO chemiluminescent substract system,KPL,Guildford,UK)共孵,然后與X光膠片在暗盒曝光5～30 min。沖洗膠片,掃描儀獲取圖像。動物實驗的相關規程嚴格按照實驗動物使用和操作指南(中國科學技術部2006年頒布)以及本院制定的相關倫理規則,旨在減輕動物所受痛苦并減少動物的使用數量。

1.8 統計學方法 采用SPSS11.5軟件包進行統計學分析。計量資料以x±s表示,兩組間均數的比較采用方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般性狀 與正常組相比,對照組大鼠普遍出現以下現象:毛色暗黃,納食減少,體質量先增加,后下降,運動緩慢,口、鼻發紺有血性分泌物,呼吸有明顯氣喘,足爪水腫,活動減少,抓取反應差。美托洛爾組經治療后心衰癥狀較對照組好轉。

2.2 血流動力學檢測結果 血流動力學檢測結果見表1。與正常組相比對照組大鼠HR、LVEDP顯著增加(P＜0.01),LVSP及±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01);美托洛爾組與對照組大鼠相比 HR、LVEDP明顯下降(P＜0.05),±dp/dtmax明顯上升(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠VWI、LVWI及病理評分 VWI結果與正常組比較,對照組VWI、LVWI顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01),左室重塑明顯;美托洛爾組 VWI、LVWI明顯增加,差異有統計學意義(P＜0.05);與對照組比較,美托洛爾組VWI、LVWI明顯下降,差異有統計學意義(P＜0.05),見圖1。病理評分結果,與對照組比較,對照組評分顯著增加,差異有統計學意義(P＜0.01);美托洛爾組較對照組評分顯著下降(P＜0.01),見圖 1。

圖1 大鼠的VWI/LVWI結果及病理評分

圖2 各組大鼠肌細胞凋亡蛋白的改變

2.4 美托洛爾對心衰大鼠心肌凋亡相關蛋白的影響 如圖2所示,對照組大鼠心肌相關凋亡蛋白被明顯激活,Bax、活化形式的caspase-9和活化形式的caspase-3的合成均明顯增加,Bcl-2的合成則明顯下降。而美托洛爾明顯提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的合成,以及下調了促凋亡蛋白Bax的合成,并且凋亡通路中關鍵的分子caspase-9和caspase-3的活化均被藥物不同程度下調。

2.5 3組大鼠心肌DNA斷片化的改變 如圖3所示,與對照組相比美托洛爾組降低大鼠心肌組織的DNA梯狀條帶(DNA ladder)的出現。

圖3 各組大鼠心肌細胞DNA斷片化的改變

3 討 論

CHE是各種心血管疾病的終末階段,預后嚴峻,文獻報道心衰的5年生存率與惡性腫瘤相仿[4]。心肌細胞是終末分化細胞,細胞增殖相對較少,因此心肌細胞單元數量的穩定對維持心功能具有重要的意義。在哺乳動物,心肌細胞再生極為有限,一定數量心肌細胞的死亡,會影響整個心臟功能[5]。心衰的實質是心室重構,而細胞凋亡在心室重構過程中發揮了關鍵作用[6-7]。細胞凋亡是引起心室重構及心功能下降的主要原因[8-9]。

細胞凋亡是遺傳基因控制的細胞自主性死亡過程,是機體清除嚴重受損的細胞、不在需要的細胞和癌變細胞的自身防御性機制[10]。心肌細胞凋亡受包括Bcl-2家族蛋白的調控和胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等的激活和調控[11]。在Bcl-2家族蛋白中,Bcl-2、Mcl-1、Bcl-W 以及 Bcl-xl具有抑制細胞凋亡作用;而Bax、Bcl-xs、bak及bad則促進細胞的凋亡。Bcl-2 protoonco-gene是一個抑制凋亡的原癌基因,而 Bax proto-oncogene是一個誘導細胞凋亡的原癌基因,Bax與Bcl-2結合,阻止Bcl-2的激活,從而促進凋亡,所以Bax、Bcl-2是調控心肌細胞的關鍵凋亡基因,兩者的比例決定心肌細胞在受到凋亡刺激后是死亡還是存活[8]。而氧自由基、細胞內鈣離子超負荷和血管緊張素(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、內皮素(ET)等神經內分泌激素的持續異常激活以及細胞因子如 TNF、干擾素-γ、IL-1、表皮生長因子、轉化生長因子-β1等眾多因素也是引起細胞凋亡的重要因素[12]。而β受體阻滯劑美托洛爾能通過對調節凋亡蛋白及交感神經活性、抑制循環中的兒茶酚胺類物質的釋放、拮抗 ET-1、TNF-α等的活性,擴張外周血管,阻斷粗細胞凋亡蛋白的合成,逆轉心室肥厚,延緩心衰的進程[13-14]。

本實驗采用皮下注射大劑量ISO方法復制CHF大鼠模型[15],對照組大鼠 LVSP、±dp/dtmax明顯下降(P＜0.01),HR、LVEDP及VWI明顯上升(P＜0.01),并出現心室肥大。心肌DNA斷片化及心肌凋亡相關蛋白表達提高,心功能明顯受損,證實CHF的心肌有大量的心肌細胞凋亡。在應用美托洛爾干預CHF大鼠后心肌細胞凋亡率減少。大鼠LVSP、±dp/dtmax明顯上升(P＜0.01);HR、LVEDP及 VWI明顯下降(P＜0.01);心室肥大明顯好轉,心肌DNA斷片化改變及心肌凋亡相關蛋白表達下降,心功能明顯改善,說明心肌凋亡是CHF心肌細胞死亡及心功能下降的主要原因之一。

本研究發現,異丙基腎上腺素誘導CHF大鼠的心肌細胞凋亡顯著上調,提示心肌細胞凋亡在實驗性CHF的發病機制中發揮著重要作用。而美托洛爾具有抑制促細胞凋亡蛋白合成,從而降低心肌細胞凋亡,改善在實驗性CHF大鼠的心功能及心室重構。

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Effect of metoprolol on myocardial cell apoptosis in rats with ISO-induced congestive heart failure

ZHAOZhi-ming,GUO Han,J IAODong-dong,et al.
(Departmentof Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region,Nanjing,J iangsu210002,China)

ObjectiveTo explore the effect of metoprolol on myocardial cell apoptosis in rats with heart failure.Methods60 male Sprague-Dawley rats were randomly allocated to the ISO-induced chronic heart failure group(n=45)receiving two subcutaneous injections of 170 mg ISO per-kilogram of body and the healthy normal group(NOR group,n=15)receiving two subcutaneous injections of 0.25 mL normal saline.At 6-week,the left ventricular ejection fraction(LVEF)was measured by echocardiogram,the remaining rats,with left ventricular ejection fraction≤45%,were randomly divided into two groups:control group(n=13),metoprolol group(8 mg?kg-1? d-1,n=14),the drugs were given by gastric perfusion.At 18-week,then the hemodynamic parameters were detected,including heart rate,left ventricular end diastolic pressure,LV systolic pressure,LVWI was measured after LV morphopathological examination.The DNA fragmentation was detected by agarose gel electrophoresis method and the Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 were detected by Western blot analysis method.Results(1)Compared with the NOR group,the HR,LVEDP,LVWI and the DNA fragmentation Bcl-2,Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in the myocardial cells were significantly increased(P＜0.01).But LVSP and±dp/dtmaxand Bcl-2 were significantly decreased in the CON group.(2)Compared with the CON group,the HR,LVEDP,LVWI and the DNA fragmentation Bcl-2,Bax,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in the myocardial cells were significantly decreased.The LVSP and±dp/dtmax and Bcl-2,significantly increased(P＜0.01)in the metoprolol group.ConclusionMetoprolol can inhibit myocardial cell apoptosis,improve heart function and reverse ventricular remodeling in rats with congestive heart failure.

metoprolol;congestive heart failure;SD rats;ISO;myocardial cell apoptosis

R365.541

A

1671-8348(2010)09-1039-03

2009-08-27

2009-09-06)

?論 著?