pGEX-4T-2-TK原核表達質粒的構建及其表達*

鐘俐強,楊斯皓,賈鈺銘,吳敬波

(四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤科 644000)

pGEX-4T-2-TK原核表達質粒的構建及其表達*

鐘俐強,楊斯皓,賈鈺銘,吳敬波△

(四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤科 644000)

目的構建含胸苷激酶基因(TK自殺基因)的pGEX-4T-2-TK原核表達質粒,觀察其在大腸桿菌中表達情況,為腫瘤基因治療奠定基礎。方法聚合酶鏈式反應(PCR)擴增TK基因片段,利用限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ將其連接至原核表達載體pGEX-4T-2內,再將連接產物轉化入大腸桿菌,挑取單菌落,提取質粒,經PCR和雙酶切鑒定后測序。將轉化正確的大腸桿菌培養過夜,異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導后觀察蛋白表達情況。結果TK基因片段成功連接至載體pGEX-4T-2中,在大腸桿菌BL21中可得到穩定表達的目的蛋白。結論pGEX-4T-2-TK原核表達質粒構建成功,為后續腫瘤基因治療研究奠定了基礎。

自殺基因;質粒構建;聚合酶鏈式反應

目前放療與化療為惡性腫瘤的主要治療手段,但腫瘤中乏氧細胞的存在是導致放、化療失敗的重要原因。基因治療的出現給惡性腫瘤的治療提供了新的思路[1]。TK基因是近年來研究最多的自殺基因,全稱為人類單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk),可與更昔洛韋(ganciclovir,GCV)一起組成HSV-tk/GCV自殺基因系統[2]。為此,本實驗將TK基因插入到原核表達載體pGEX-4T-2內,并觀察其在大腸桿菌BL21中的蛋白表達情況,為進一步研究將構建好的重組質粒轉染厭氧菌(如雙歧桿菌)后能否解決腫瘤乏氧區放、化療抗拒,以為提高治療效果打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與載體 質粒pORF-HSVtk購自Invivogen公司,表達型質粒載體pGEX-4T-2由四川大學華西醫學部公共衛生院汪川老師惠贈,大腸桿菌BL21由四川瀘州醫學院附院分子生物學中心實驗室提供。

1.1.2 主要試劑 質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自OMEGA公司;聚合酶鏈反應(PCR)擴增試劑盒、BamH I、Sal I限制性內切酶、T4 dNA連接酶購自TaKaRa公司;LB培養基購自青島海博公司;SDS-PAGE電泳全套試劑盒購自天根生化公司,引物按照分子克隆實驗指南引物設計原則,并且加入特定的酶切位點,由賽百盛生物公司合成。

上游引物:5′-CGCGGATCC ATGGCCTCGTACCCCGGCCATCAACAC-3′BamH I;下游引 物:5′-ACGCGTCGAC TCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGG-3′Sal I。

1.2 方法

1.2.1 pORF-HSVtk、pGEX-4T-2質粒的抽提 大腸桿菌DH5α100μ L加入50 mL LB液體培養基,250 r/min 37℃搖菌過夜。用OMEGA公司質粒小提試劑盒提取質粒(按說明書進行操作)。

1.2.2 目的基因片段的擴增及回收 以pORF-HSVtk質粒DNA為模板,PCR擴增TK基因片段。50 μ L反應體系中含10×PCR buffer(Mg2+plus)5 μ L、質粒 DNA 模板 1.0 μ L、dNTP(2.5 mM)4μ L 、上下游引物各 1 μ L、TaqDNA 聚合酶(2 u/μ L)1 μ L。反應參數:94℃預變性 5 min后,94℃變性60 s,55℃退火90 s,72℃延伸75 s,35個循環后,72℃最終延伸20 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線燈下切割含有目的條帶的凝膠塊,利用凝膠回收試劑盒進行目的片段回收。

1.2.3 目的基因片段與載體連接及鑒定BamH I、Sal I限制性內切酶雙酶切目的基因片段和pGEX-4T-2載體,后在T4 dNA連接酶作用下,16℃連接過夜,構建pGEX-4T-2-TK重組質粒。取連接產物轉化至Nishimmra法[3]制備的大腸桿菌BL21感受態細胞中,涂布于含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上過夜培養。選取平板上生長狀態良好的單個陽性菌落適量擴增后提取質粒 DNA,行BamH I、Sal I限制性內切酶雙酶切后,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結果。

1.2.4 重組質粒測序 將鑒定正確的菌落接種至含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的 LB液體培養基中擴增.取適量菌液送測序。測序工作由英駿公司完成。

1.2.5 目的蛋白在大腸桿菌中的表達 (1)將攜帶有重組質粒pGEX-4T-2-TK的大腸桿菌接種至5 mL含有氨芐青霉素(100 μ g/mL)的 LB培養基中37℃過夜培養;(2)將過夜菌按1∶50比例分別接種到5 mL含相應抗生素的新鮮LB管中,37℃劇烈搖動培養1.5～3 h,至菌液的OD600 nm值達到0.6～0.8;(3)加IPTG誘導前從各管菌液中分別取出1 mL,保存在4℃冰箱中,作為未誘導對照;(4)在各管菌液中加入IPTG,使其終濃度為1 mM,25℃150 r/min誘導過夜;(5)分別用1.5 mL離心管收集誘導前后樣品各1 mL,12 000 r/min離心1 min,棄去上清液,收集菌體;(6)在菌體沉淀中加入1×SDS上樣緩沖液(可根據菌體沉淀量相應調整上樣緩沖液量),重懸混勻,于100℃水浴煮沸6 min,SDS-PAGE上樣前12 000 r/min離心2 min;(7)取 10～20 μ L上清液上樣,進行 12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳;(8)0.1%考馬斯亮藍G-250染液染膠,脫色至蛋白條帶清晰可見時,分析蛋白質表達結果。

2 結 果

2.1 PCR擴增目的片段結果 將PCR產物進行1%的含EB的瓊脂糖凝膠電泳,紫外線燈下可見熒光條帶,TK基因片段約為1 100 bp,擴增的片段大小與預計一致,見圖1。

圖1 TK基因的PCR擴增電泳圖譜

圖2 pGEX-4T-2-TK重組質粒的雙酶切

2.2 重組質粒的酶切鑒定 重組質粒pGEX-4T-2-TK分別用BamH I、Sal I酶切,切出片段約為 1 100 bp,4 900 bp,與預計大小一致,見圖2。

2.3 重組質粒pGEX-4T-2-TK測序鑒定 DNA測序結果與GENBANK提供的TK基因序列完全一致,同源性達100%,從第25個堿基開始為TK基因序列,第19～24堿基為引物的5′端添加的限制性酶切位點 BamHⅠ,第 16～18堿基為引物的5′端添加的3個保護堿基;第15堿基之前為載體pGEX-4T-2上的序列。證明TK基因己成功克隆到克隆載體pGEX-4T-2內,見圖 3。

圖3 pGEX-4T-2-TK重組質粒測序鑒定部分序列結果

2.4 重組質粒pGEX-4T-2-TK在大腸桿菌中的表達 陽性轉化菌經IPTG誘導培養后,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,較未添加IPTG組可見目的蛋白條帶產生,說明作者構建的原核表達質粒成功,可以表達目的蛋白,達到實驗要求,見圖4。

圖4 pGEX-4T-2-TK蛋白在BL2l中的表達

3 討 論

理想的腫瘤基因治療載體應具備的最重要特性就是對宿主無毒性以及對腫瘤的高度靶向性[4]。現階段腫瘤基因治療載體系統主要包括病毒載體系統[5]和非病毒載體系統,病毒載體系統包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純皰疹病毒載體,其中腺病毒載體為目前應用最廣泛的病毒載體[6-7]。其優點是高效轉染和高效表達,缺點是腺病毒在感染增殖較快的腫瘤細胞同時,也會感染機體增殖快的正常細胞,如上皮細胞,導致一些急性毒性反應,同時由于其自身的免疫原性,多數人群接觸過病毒后體內會產生病毒特異性抗體,再次應用同一種病毒載體會被首次應用產生的大量免疫中和抗體所中和;而且給藥途徑也存在著諸多問題,通過靜脈輸入病毒載體是否安全,尚未得到確認,目前臨床試驗只能靠局部瘤內注射給藥。因此病毒載體的毒性反應、免疫反應及給藥途徑限制了病毒載體在臨床上的應用[8]。非病毒載體系統包括:裸DNA、脂質體、多聚物及分子耦聯體,臨床試驗中最常用的是真核細胞表達質粒[9]。非病毒載體的優點是安全、制備簡單和攜帶外源基因較大;缺點是靶向性差,基因導入體內后轉染效率低、表達水平不夠理想。

研究表明絕大多數實體瘤因腫瘤實質細胞增生迅速,而血管形成相當緩慢,造成實體瘤內部大面積缺氧[10]。雙歧桿菌屬厭氧菌屬,能靶向聚集至腫瘤乏氧區域[11]。在安全性方面,雙歧桿菌對人體來說是腸道益生菌,不會產生不良反應。Sasaki等[12]將轉染前藥轉換酶基因的長雙歧桿菌通過尾靜脈注射到豚鼠體內,未見任何過敏反應出現,也未檢測到由雙歧桿菌介導產生的特殊抗體。因此本實驗用雙歧桿菌作為基因治療運載體將TK自殺基因靶向運至腫瘤組織,文獻報道雙歧桿菌自身具有抗腫瘤作用[13-14],康保國等[15]研究表明TK基因可經放射誘導表達,可以與放療產生協同作用,進一步提示其是一個很有前途的腫瘤基因治療運輸載體。但雙歧桿菌是原核生物,因此必須要原核表達質粒才能在雙歧桿菌體內表達。基于此,本實驗選用了pGEX-4T-2原核表達質粒,因為該質粒帶有非常強的tac啟動子,融合蛋白表達系統可以克服轉錄與轉錄后水平對外源基因表達可能帶來的不利影響,便于融合基因翻譯起始,是一種高效的蛋白表達載體,且便于目的蛋白的進一步分離純化。目前TK基因主要與腺病毒基因重組后,再結合前藥更昔洛韋觀察體外對腫瘤細胞的殺傷作用,尚無TK基因與pGEX系列載體重組的報道。安麗娜等[16]研究表明,將胞嘧啶脫胺酶(CD)自殺基因與pGEX載體重組后再轉入雙歧桿菌,自殺基因能很好表達,對黑色素瘤細胞有較強的殺傷力。因此將構建好的pGEX-4T-2-TK原核表達質粒轉入雙歧桿菌后,可望克服病毒載體不能靜脈給藥的局限,實現載體安全性與靶向性的統一。

本實驗構建的pGEX-4T-2-TK原核表達載體,經過雙酶切、PCR擴增、測序等鑒定表明重組質粒構建成功,并在大腸桿菌BL21內能穩定表達,為進一步研究轉入雙歧桿菌后能否靶向殺傷惡性腫瘤細胞打下了基礎。

(志謝:感謝瀘州醫學院附屬醫院腫瘤科放射生物與生物治療實驗室楊玲麟博士及汪碧瓊老師對本研究提供的技術性幫助。)

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Construction and expression of pGEX-4T-2-TK plasmid in procaryote*

Z HONG Li-qiang,Y ANG Si-hao,J I A Yu-ming,et al.
(Department of Oncology,Y ibin Second People's Hospital,Yinbin644000,China)

ObjectiveTo construct the plasmid of pGEX-4T-2-TK containing the TK suicide gene,and then to observe its expression in E.coli.MethodsThe TK suicide gene fragments were amplified from the plasmid of pORF-HSVtk by PCR.The PCR product was digested by the restriction endonucleases BamH I and Sal I.Then we used the same method to deal with the vector of pGEX-4T-2.The recombinant plasmid was transfected into E.coli.The recombinant plasmid was extracted and identified by PCR and enzyme-digestive method,and the sequence was measuerd.The E.coli with correct plasmid was cultured with IPTG over night to induce the protein's express.ResultsThe TK suicide gene fragments were correctly ligated with the vector of pGEX-4T-2.The purpose protein could be expressed stably.ConclusionThe plasmid of pGEX-4T-2-TK was constructed successfully.It will provide the basis for future study on treating carcinoma by transfect the recombinant plasmid into bifidobacterium.

suicide gene;plasmid construction;polymerase chain reaction

R730.54;R446.61

A

1671-8348(2010)09-1036-03

四川省衛生廳科研課題(0331)。△

,E-mail:wjb6147@163.com。

2009-08-30

2009-09-28)

?論 著?