血管內皮祖細胞在創傷修復與改善皮瓣血運中的研究綜述

鄭勝武 鄭清健

福建醫科大學省立臨床學院（350001）

血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一種能直接分化為血管內皮細胞的前體細胞。EPC形成于胚胎期，胚外造血啟動，卵黃囊的胚外中胚層的一些間充質細胞逐漸聚集成條索或團塊狀，形成血島，血島進一步出現腔隙化改變，中央的細胞分化成造血干細胞，外周細胞則分化為EPC[1]。由于它們共同表達CD133，EPC與造血干細胞被認為來源于同一前體細胞，即胚層造血/成血管細胞[2]。

以前觀點認為，EPC僅僅出現于胚胎血管發生階段，參與人胚胎血管的生成，人出生后即不存在。Asahara等[3]、Shi等[4]分離并證實人類出生后的外周循環血液中存在著能分化為血管內皮細胞的EPC，它在成年機體的血管新生中起重要作用。這一重大發現，為揭開出生后血管新生的機制提供了重要線索。目前，已經證實骨髓來源的EPC對于創傷愈合[5]、肢體缺血[3,6-8]、心肌梗死[9,10]、血管移植物的再血管化[5,11,12]等過程中的血管再生起著重要作用?，F將EPC在創傷修復與改善皮瓣血運中的作用機制及研究進展綜述如下。

1 EPC促進血管生成的機制

1.1 EPC的動員

不同祖系的細胞由骨髓釋放到外周血稱為動員，細胞動員機制存在著共同的環節，如黏附、降解、運動、遷移等，但各祖系細胞也有特異性的動員機制。局部的血管損傷能有力地刺激EPC的動員，在缺血、燒傷、創傷等情況下，周圍血中的EPC明顯增高[5]。調節EPC動員的生長因了包括血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、粒細胞集落刺激因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子[13]，它們是通過間接作用于骨髓基質細胞上的受體起作用的，同時VEGF也是EPC的趨化劑，促使EPC趨向缺血組織，其他的細胞因子如IL-3、IL-8、IL-11、干細胞因子及巨噬細胞炎癥蛋白la[13]作用不如前3種。EPC與VEGF的關系十分密切，在血管形成的研究中應用VEGF基因治療周圍血管及冠狀動脈疾病時，發現血液循環中的EPC數量明顯增加，提示原來利用VEGF基因治療成功的原因部分可能是促進EPC的動員，使其數量增多從而發揮作用[14]。

1.2 EPC與血管新生

血管新生存在兩種機制，即血管形成和血管生成。血管形成是血管內皮細胞增殖、遷移，微血管以出芽的方式從已存在的血管床長出形成新的血管分支及毛細血管叢；而血管生成是來自中胚層的血管干細胞，尤其是骨髓來源的EPC原位分化形成血管[14]。傳統的觀點認為血管形成只存在于成體，而血管生成僅限于胚胎。隨著EPC在成體的分離成功，證明血管生成也發生于成體。因此，血管形成、血管生成可能是人類血管新生的基本過程[14]。

1.2.1 治療性血管形成

利用有促進血管生長作用的生長因子[15]，如VEGF、堿性成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子來促進血管內皮細胞增殖、遷移，從而加強血管形成的治療方法。應用這類因子（重組蛋白）治療，由于達到療效所需要的劑量大、維持時間短、療效不佳，已很少采用；目前主要以基因轉染技術來實現治療部位生長因子的持續性分泌，來達到治療目的[16]。但一些研究結果尚不肯定，許多學者認為單個生長因子難以產生明顯的臨床效果[14,17]。

1.2.2 治療性血管生成

利用成年機體血液循環中的EPC對缺血組織趨向能力及分化形成血管的生物學性能，可以通過移植EPC或通過誘導趨化、促進EPC動員、增生，使缺血組織局部的EPC數量增多，從而促進成體的血管生成，這種治療稱為“治療性血管生成”[14]。目前已經證實骨髓來源的EPC對于創傷愈合、肢體缺血、心肌梗死、血管移植物的再血管化等過程中的血管再生起著重要作用。部分研究中心已經將EPC應用于心肌缺血、外周缺血性疾病治療中，證實了其良好的治療潛力[18,19]。

1.3 EPC的治療作用

EPC發揮治療作用通常被認為是通過兩種機制完成的：通過旁分泌多種促進血管新生的因子；分化為成熟的血管內皮后，參與新的血管形成[18,20,21]。與治療性血管形成相比，利用EPC的治療性血管生成有幾個優點：首先，作為一種以細胞為基礎的治療方法，它不只是能給予受體EPC，而且同時能分泌對血管新生重要的多種生長因子[18,20,21]，He等[22]檢測到體外培養的EPC可以分泌VEGF、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子等數十種生長因子。其次EPC具備歸巢能力，可以向血管創傷或缺血部位趨化，能在最需要血管新生的部位發揮作用[8]，而且自體的EPC移植無毒性及免疫反應。這些特性使EPC能成為生長因子基因轉染的靶細胞，有可能使血管形成和血管生成互相協同、互相促進。EPC在成人機體循環細胞中所占的比例非常小，因此，建立一種良好而有效的體外誘導培養方法，通過體外擴增的方法獲得一定數量和純度的EPC，是將其成功再移植入體內促進受區血管新生的基礎。

2 EPC的分離、培養

EPC可以從各種來源中分離，比如骨髓[7,8]、外周血[3]和臍帶血[23]等。分離的方法包括根據細胞的表面標志（一般為CD34+、CD133

+、VEGFR2+細胞或其任意組合），通過流式細胞儀[24]或免疫磁珠[25]分離出目標細胞群，然后采用貼壁培養法獲得。這種方法獲得到的細胞較純，但是通常由于分離的細胞數量少，難以滿足實驗研究的需要；并且分離過程相對復雜，費用昂貴。同時，目前對EPC的表型仍然存在爭議，有研究發現細胞也能分化成內皮樣細胞[26,27]，所以上述表面標志僅具有相對特異性。目前采用比較多的分離方法是通過等密度梯度離心法，然后在專有的內皮細胞誘導培養液中培養[27]。Zan等[28]研究發現，①細胞密度過低時細胞不易存活，適當增加接種細胞密度（106～107/mL），有利于細胞的貼壁、增殖和分化；②原代培養的細胞缺乏細胞間的支持，培養皿預包被纖維粘連蛋白，起支架和促進黏附作用，可以增加貼壁細胞的數量；③培養基的血清濃度不宜過高，一般以5%為宜，過高的血清濃度可能促進細胞向其他方向分化。

3 EPC在創傷修復與改善皮瓣血運中的研究進展

3.1 EPC在創傷修復中的研究進展

創傷修復愈合過程中涉及組織對創傷的一系列復雜反應及多種細胞與周圍介質相互作用的過程，組織愈合過程中一個很重要的因素是促進血管新生、血運及時重建，減少因缺血導致的組織壞死，促進新生組織的再生。特別是糖尿病患者，損傷后傷口難以愈合，經常發展成為慢性潰瘍。在許多病例中，利用VEGF等生長因了治療可以促進血管生成，但在一些糖尿病或高膽固醇血癥病例中，血管內皮細胞功能缺陷，VEGF等生長因子幾乎不起作用，但EPC能克服這種限制，可以提供有活力的血管內皮細胞，因此能促進伴有糖尿病、高膽固醇血癥損傷缺血部位的血管新生及愈合[13]，目前國外EPC用于損傷修復的研究主要集中在糖尿病的創面修復[14]。

3.2 EPC在改善皮瓣血運狀況中的研究進展

利用EPC的治療性血管生成治療可以在皮瓣中促進血管新生，可以減少皮瓣的壞死，提高成活率，可以縮短皮瓣斷蒂時間，減少皮膚壞死并發癥。EPC具有定向遷移的特性，不但趨向并聚集于缺血肢體和心肌，同樣也可以趨向于缺血的皮瓣組織。2004年Park等[29]首先報道了成人外周血單個核細胞誘導的EPC可以促進裸鼠隨意皮瓣的存活面積；2009年Zan等[28]報道骨髓來源的EPC可以促進大鼠預構皮瓣血管新生，提高皮瓣存活率。另外，EPC可以作為VEGF等生長因子基因轉染的靶細胞，同時聯合治療可以取得更好的效果。易成剛等[30]利用脂質體介導血管內皮細胞生長因子165（VEGF165）基因體外轉染EPC、然后移植于裸鼠隨意皮瓣，皮瓣旱期斷蒂。結果發現轉染VEGF165基因的EPCs組和EPCs組移植裸鼠皮瓣后，EPCs整合到缺血部位新生血管中，與對照組的皮瓣存活率分別為97.2%±2.8%、60.3%±2.1%、34.2%±1.8%（P＜0.05），而且前兩組毛細血管密度、血流灌注差異均有統計學意義（P＜0.05），較對照組均有明顯改善（P＜0.05）。由此得出結論：臍血中的EPCs體外培養后移植體內可促進缺血皮瓣的血管新生，提高存活率，而轉染VEGF165基因的EPCs具有更強大的促血管新生的作用。

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