結節性硬化癥基因研究發展狀態綜述

吳貴賢 崔茂榮 張小德 徐躍文 陳 釗 張學剛 李 翔

曲靖市第一人民醫院泌尿外科（655000）

結節性硬化癥（tuberous sclerosis，TSC）是以錯構瘤為主要表現的累及多個系統和器官的常染色體顯性遺傳性疾病。TSC1和TSC2兩個腫瘤抑制基因是該病的致病基因，TSC基因除了通過TSC-Rheb—-TORS6K1/4EBP1途徑調節細胞增殖外還參與了細胞黏附、細胞內吞等重要的生物學功能，其功能除了與TSC綜合征密切相關外，在其他散發性腫瘤中的作用也受到越來越多的重視。調節細胞的生長和分化、表達產物、TSC 基因具有腫瘤抑制性、TSC蛋白活性的調節等。目前以特異性抑制mTOR為主要作用原理的藥物已進入臨床開發，TSC基因也有望作為腫瘤發生和治療研究的新的靶分子。

1 TSC1、TSC2特性

TSC 是以錯構瘤為主要表現的累及多個系統和器官的常染色體顯性遺傳性疾病。TSC1和TSC2兩個腫瘤抑制基因是該病的致病基因。TSC基因含有23個外顯子，第1、2外顯子不具有編碼功能，轉錄產物為相對分子質量為8.6的mRNA，編碼相對分子質量為130×103、由1164個氨基酸組成的錯構瘤蛋白。TSC2基因含有41個編碼外顯子和1個無編碼意義的引導外顯子，轉錄為相對分子質量為5.5的mRNA，編碼相對分子質量為190×103，由1807個氨基酸組成的馬鈴薯球蛋白（tuberin）。上述兩種蛋白可形成一種復合體，參與調節細胞的增殖、生長、黏附及囊泡運輸等[1]。Jones等[2]發現80%的TSC患者可以檢測到突變，且大部分突變發生在TSC2基因上，約占總突變檢出率的82%。姚鳳嗚等[3]采用直接測序法對2例漢族TSC 患者（一為家系，一為散發）進行突變篩查，結果發現了TSC2基因的1個無義突變c.1372 C＞T（p.R458x）和1個移碼突變5238-5255 del 18bpCATCAAGCGGCTCCGCCA。無義突變c.1372 C＞T（p.R458X）發生在TSC2基因第13號外顯子上，導致TSC2基因翻譯第458位氨基酸蛋白產物時提前出現終止密碼子，形成1個截斷蛋白。馬鈴薯球蛋白（tuberin）包含7個功能結構域，從N端到C端依次為：亮氨酸拉鏈區（1eucine zipper domain，LZD）、CCD1、CCD2、TAD1、GAPD、TAD2、鈣調蛋白結合區（calmodulin-binding domain，CaMD）。本突變恰位于馬鈴薯球蛋白CCD1和CCD2兩功能區之間，導致CCD2、TAD1、GAPD、TAD2和CaMD 5個功能結構域的丟失，這是導致該患者臨床表型的主要原因。Rose等[4]曾通過單鏈構象分析法檢測到相同的突變，但在中國漢族人中屬首次報道。移碼突變5238-5255 del 18bp CATCAAGCGGCTCCGCCA 1746 del HIKRLR位于TSC2基因40號外顯子上，Beauchamp等[5]曾于1998年報道過此突變，國內也有報道。該突變位于馬鈴薯球蛋白鈣調蛋白結合區CaMD。Noonan等[6]研究顯示，CaMD是馬鈴薯球蛋白調節甾體激素受體所必需的結構，故發生于該區域的突變可能參與了該疾病的發生。TSC是一種表型多樣的疾病，Dabora等[7]均曾經對224名TSC患者進行突變檢測發現，TSC2基因發生突變的患者其臨床表現更嚴重，較易發生智力發育遲緩、癲癇、面部血管纖維瘤及視網膜錯構瘤等。Zhao等[8]對國內報道的20個TSC基因突變報道進行分析，也支持上述觀點。姚鳳嗚等[3]通過聚合酶鏈反應及DNA直接測序的方法對中國漢族人群中2例TSC患者進行突變檢測，發現1個無義突變和1個移碼突變，表明TSC2基因突變是中國TSC患者的分子發病機制，為該病患者進行產前診斷及遺傳咨詢以及進一步的蛋白功能學研究奠定了基礎。

2 TSC 的遺傳異質性

TSC1 基因定位于第9號染色體長臂上（9q34），與AKI和ABO血型基因有連鎖關系，其蛋白產物被稱為hamartin[9]，TSC2 基因定位于第16號染色體短臂上（16p13.3），與Ⅰ型多囊腎（PKD）基因近端的DNA標記有連鎖，其蛋白產物被稱為tuberin。由于TSC有遺傳異質性，故由2個不同基因型引起的臨床表現是否一致值得進一步研究。在某些情況下，遺傳異質性有助于解釋諸如多發性神經纖維瘤等臨床的不同形式。然而，除了鄰近基因缺失綜合征，TSC1和TSC2基因異常都可引起所有的TSC并發癥，由這2個基因或特異性突變引起的表現型也許有輕微的不同。有證據表明，TSC2突變引起的疾病較TSC1更嚴重，但這一點仍需要進一步證實[10]。最近有研究發現hamartin和tuberin的細胞內作用途徑相同，因此認為兩者的臨床表現無明顯差異[11]。

3 基因的功能

已知TSC 的兩個基因都是抑癌基因，它們的功能是調節細胞的生長和分化。當兩個基因發生突變時，它們對細胞的生長調節失控，致使腫瘤形成。一些TSC的錯構瘤患者顯示了雜合性的丟失，TSC患者中9q34或16p13的標記是雜合性的，但在腫瘤中則是純合性的[12,13]。雜合性的丟失說明TSC患者通過遺傳或胚胎早期的基因突變造成1個基因復本的缺失，且僅在以前正常的復本有1個體細胞的突變時才會發病。最近對Eker小鼠（TSC動物模型） 和turbin 蛋白細胞內功能的研究進一步支持了腫瘤抑制假說。Eker小鼠在TSC2基因有一個突變時，可發生顯性遺傳的腎細胞癌、室管膜下和皮質下錯構瘤。重新誘導一個野生型TSC2基因可抑制該模型中腎腫瘤的發展[14]。同源性序列研究發現tuberin和GTP酶激活蛋白GAP3具有部分同源性[15]，已知GTP酶參與細胞生長和分化的調節，因此認為tuberin也許有調節這一活性的作用。

4 TSC的鄰近基因缺失

多囊腎在TSC 中較常見，其發病與TSC1和TSC2基因有關。一些多囊腎病發病較早，臨床癥狀較重，多由一個鄰近基因缺失所致，同時影響TSC2和PKD1基因[16]。對診斷TSC 的患兒若懷疑合并多囊腎，應進行雙腎超聲檢查。

5 TSC的鑲嵌性

TSC2和PKD1鄰近基因缺失的患者其臨床表現較輕，這是由于他們的鄰近基因缺失是體細胞鑲嵌體的，即體細胞后天自發的突變。體細胞鑲嵌體有兩個或多個細胞系，但只有2個等位均發生突變的細胞系，才會導致生長和分化的紊亂。體細胞鑲嵌體在伴有或不伴有鄰近TSC2-PKD1 綜合征的TSC1和TSC2患者都被報道過[17,18]。鑲嵌型疾病的病情程度差異很大，有的也可以很嚴重。一般情況下，如果細胞系的異常被確定在性腺（性腺鑲嵌體），那么表現型正常的父母所生子女受影響的危險性就較高，但在TSC 時并不發生這種情況，研究證實父母未受影響養育一個TSC小兒后，下一胎受影響的風險率僅為2%～3%[19]。

6 TSC蛋白的磷酸化調節

當細胞環境發生改變時，tuberin被磷酸化，改變對mTOR的抑制作用。參與tuberin磷酸化的信號通路主要包括PI3K/Akt、ERK/RSK1、LKB1-AMPK等。在有絲分裂期間，PI3K/Akt磷酸化tuberin，降低其GAP活性，負性調節hamartin/tuberin復合體的腫瘤抑制功能[20]。最近發現ERK（extracellular signa1-regulated kinase）活化靶基因RSK1后能夠結合并磷酸化tuberin，抑制其功能[21]，ERK也可通過直接磷酸化tuberin特異的氨基酸位點如s664位點，導致hamartin/tuberin解離，大大消弱tuberin抑制mTOR信號、細胞增生和細胞癌性轉化的能力，參與腫瘤的形成[22]。此外還存在一個正性調節TSC2的磷酸化機制，LKB1是Peutz-Jeghers綜合征中發生突變的腫瘤抑制基因，可以磷酸化細胞內能量狀態感受器AMP依賴蛋白激酶（AMP dependent protein kinase，AMPK）進而磷酸化激活tuberin，增強hamartin/tuberin復合體的GAP活性，抑制Rheb依賴的mTOR活性[23]。

7 TSC蛋白的泛素化調節

許多細胞內的蛋白被泛素化降解，其共同特點是存在一個PEST元件，序列研究發現tuberin也存在PEST元件。Benvenuto等[24]發現hamartin與tuberin的結合可使其免受泛素化。hamartin也可被泛素化，但是程度較小，可以通過與tuberin共表達保持穩定。Pam是神經元特異性蛋白，能夠調節突觸的生長，其末端包含一個與tuberin結合的RING鋅指結構域，可能通過該結構域作為E3泛素化連接酶，與tuberin相互作用，調整hamartin/tuberin復合物被泛素化降解的過程[25]。HERC1（HECTdomain and RCC1 domain）屬于E1泛素化連接酶，可以與tuberin相互作用，hamartin/tuberin復合體的形成可抑制tuberin與HERC1的相互作用，使tuberin保持穩定[26]。

8 TSC基因與疾病發生

Tuberin和hamartin作為腫瘤抑制因子，雜合性缺失（1oss of heterozygosity，LOH）或二次打擊突變常發生在多種與結節性硬化相關的錯構瘤或腫瘤中，如淋巴管平滑肌增多癥（LAM），腦巨細胞星形細胞瘤和腎臟腫瘤。最近有數據表明，TSC基因LOH或者突變導致蛋白的功能失活可能與一些非TSC疾病相關腫瘤如散發性膀胱癌、卵巢癌、膽囊癌、鼻咽癌、肺腺癌、子宮內膜癌和非小細胞肺癌等有關[27-33]。Jiang等[34]研究了TSC基因在乳腺癌中的表達，結果發現TSC基因mRNA和蛋白水平表達降低，而且TSC基因的低表達與乳腺癌的侵襲性增強和低生存率有關。Wienecke等[35]通過逆轉錄PCR和免疫印記分析了49例成人、10例兒童非TSC室管膜細胞瘤患者TSC2 mRNA和蛋白表達水平。結果表明存在TSC2表達降低和缺失，但主要針對成人。Kataoka等[36]通過免疫組織化學和逆轉錄PCR分析了42例胰腺癌患者中tuberin的表達水平，24例（57%）腫瘤標本tuberin表達陰性且TSC2在腫瘤組織中的表達較相應的非腫瘤組織中表達要低。

9 TSC1與TSC2的腫瘤抑制性

根據Knudson 腫瘤抑制基因突變和體細胞二次突變學說（即腫瘤易感性和腫瘤發生學說），TSC錯構瘤基因突變的多樣性表明TSC基因是一個腫瘤抑制基因。腫瘤抑制基因能夠抑制細胞的惡性轉化，對正常細胞的增殖起負性調節作用，該基因失活常常表現為一個等位基因缺失和另一個殘留等位基因的突變，等位基因缺失就是由腫瘤中常見的染色體區域或片段缺失所致，同時會伴有腫瘤抑制基因相鄰區域的雜合性缺失（LOH）。通過LOH分析及檢查基因組特定染色體上多態標記，可定位腫瘤抑制基因并能發現新的腫瘤抑制基因的位點。多種形式的TSC1和TSC2等位基因及相鄰區域雜合性缺失，與TSC2位點相比，LOH較少發生于TSC1位點上。LOH在TSC1和TSC2位點上的發生率不同，可能是由于在散發患者中，TSC1和TSC2種系突變發生率不同，也可能是由于在2個位點上LOH和小突變（包括小片段缺失或插入、點突變、沉默突變） 相對發生率不同所致。

10 展 望

隨著TSC1和TSC2基因的定位及克隆，使人們對TSC 的分子發病機制有了一定的了解，為TSC的基因診斷和治療創造良好的條件。目前TSC1 和TSC2 基因與腫瘤抑制基因之間的關系需進一步明確，它們的表達產物錯構瘤蛋白和馬鈴薯球蛋白的功能及相互作用尚不清楚，相信隨著研究的深入，人類最終能實現TSC 的基因治療。

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