耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因的研究進展

王鳳玲, 侯英榮, 馮秀河

金葡菌是臨床最常見的病原菌之一,在臨床分離菌中分離率位居前列,其中以MRSA臨床意義尤為重要。由于其多重耐藥性和易造成醫院感染的暴發流行,已成為臨床抗感染治療的一大難題[1]。金葡菌可引起一系列的化膿性感染、食物中毒及中毒性休克綜合征等,其化膿性感染從小的皮膚感染病變如癤、癰到嚴重的感染如組織壞死、壞死性肺炎、骨髓炎和心內膜炎等。其釋放的毒素可引起全身非特異性炎癥反應,并導致難以控制的敗血癥,嚴重者造成多器官功能障礙甚至死亡。攜帶毒素因子[如Panton-Valentine殺白細胞素(PVL)、中毒性休克素I(TSST-I)、金葡菌腸毒素(SE)]的金葡菌毒力更強,與感染后疾病的嚴重程度相關。MRSA對抗生素的耐藥性日趨嚴重且對多種抗生素耐藥,因此MRSA引起的醫院感染一旦發生,常難以控制。本文對MRSA耐藥基因及致病毒素基因等作綜述。

一、MRSA耐藥基因

MRSA對β內酰胺類的耐藥性系由mecA基因決定,此基因負責編碼青霉素結合蛋白PBP2a(PBP2a),該蛋白是一種酶,與β內酰胺類抗生素的親和力很低,但其生理功能與細菌本身固有的PBPS相同。PBPS介導細菌細胞壁合成過程中肽聚糖的交聯,對細菌生長繁殖、保持正常形態起重要的作用。PBPS是β內酰胺類抗生素與細菌結合的靶位,與抗生素有高度的親和力,β內酰胺類抗生素與PBPs共價結合后使其失去酶活性,使細菌細胞壁合成障礙而導致細菌死亡。PBP2a起了PBPS功能,使細菌細胞壁合成不受影響,維持其細菌的存活并生長,使MRSA表現出耐藥性[2]。MecA是MRSA耐藥的決定因子,是金葡菌環狀染色體上一個外來的大小為30～50 kb的插入片段,mecA基因位于葡萄球菌染色體mec盒(Staphylocossal cassette chromosome mec,SCCmec)上,SCCmec包括mec基因復合體和負責移動的染色體重組基因ccr。

mec基因復合體由結構基因mecA和位于其上游的調節基因mec R1和抑制基因mec I組成,三者控制著MRSA耐藥性的表達程度,其中mecA編碼PBP2a,mecI編碼的抑制因子(MECⅠ蛋白)結合在mecA基因的啟動子部位,使mecA基因不能被轉錄;mecR1在誘導劑(如β內酰胺類抗生素)的作用下編碼產生誘導因子 (MECR1蛋白),能夠去除MECI蛋白對mecA的阻遏作用,使mecA轉錄產生PBP2a[3]。mec A基因的表達還受BlaR1和BlaI基因的調節,研究表明兩者與mecR1和mecI基因有高度的同源性。Mec復合體分為4種即classA：mecI-mecR1-mecA、 classB： △ISI1272-mecR1-mecA 、classC：IS431L-△mecR1-mecA,其中 C1、C2的 IS431L方向相反、classD：△mecR1-mecA。

染色體盒重組基因復合體(cassette chromosome recombinases,ccr)由2種位點特異性重組基因(ccrA和ccrB)與其相鄰的orf s組成,位于SCC-mec的近中部,ccrA、ccrB基因編碼的重組酶對于SCCmec的可移動性起重要的作用,ccr分為4種(ccrAB1 、ccrAB2、ccrAB3 和 ccrC),根據 mec復合體和ccr的不同組合,可將SCCmec分為6型[4],即Ⅰ型 class B mec+type 1 ccr、Ⅱ型 class A mec+type 2 ccr、Ⅲ型 class A mec+type 3 ccr、Ⅳ型class B mec+type 2 ccr、Ⅴ型class C2 mec+type 5 ccr和Ⅵ型classβmec+type 4 ccr,其中Ⅱ、Ⅲ型是醫院感染MRSA的常見類型,Ⅳ、Ⅴ型社區感染的常見類型。

研究表明PBP2a產量與MRSA耐藥水平的高低及MIC值并無相關性,PBP2a產量相同的MRSA的MIC值可相差很大,這提示除了mecA基因外還有其他耐藥基因。femA、f emB、f emC、f emd、femE和f emF是金葡菌染色體上的固有基因,與甲氧西林的耐藥表達有關,這些輔助基因與mecA基因的協調作用產生對β內酰胺類抗生素的高度耐藥性,這是由染色體介導的固有耐藥。HmrC、hmeD、chr基因是染色體突變基因,引起金葡菌對甲氧西林的高度耐藥,其機制尚未明確。另外mecA基因的表達還受環境因素如pH、濕度、2價金屬離子及生長溫度的影響。

20世紀90年代初已開始報道應用PCR檢測mecA基因,近年來許多國家已成功檢測到mecA基因并應用于臨床。PCR法檢測MRSA具有較高的靈敏度和特異度,操作簡單、準確、快捷,結果直觀。按照NCCLS 2004年版建議,凡檢測出mecA基因或PBP2a即可確定為MRSA。由于抗生素種類不斷增加及臨床上應用不盡合理,MRSA引起的感染呈逐年上升趨勢,且MRSA多重耐藥性日趨嚴重,所引起的全身感染的病死率高達50%以上。文獻報道1993年日本Cansai醫科大學附屬醫院MRSA分離率為 41.0%,1999年英國30個監測中心MRSA檢出率高達56.7%,1999年美國疾病控制中心(CDC)統計全美重癥監護病房內感染患者MRSA陽性率占 53.2%。我國MRSA的感染率也相當高,1997年我國臺灣臨床上MRSA的檢出率占70.7%,1998年上海地區的MRSA分離率為70.7%,1997年北京檢出率為52.9%,提示MRSA引起的感染已非常普遍。

二、PVL及PVL基因

PVL是金葡菌產生的細胞外毒素,PVL、γ溶血素和其他殺白細胞素均屬于synergohymenotropic毒素家族。PVL由兩種蛋白質組成,即S和F蛋白(LukS-PVT LukF-PV),其分子量分別為34 ku和33 ku,兩種組分各有不同的生物活性和功能,對人體的多形核白細胞(PMNs)和巨噬細胞具有高度的特異性,F蛋白和S蛋白之間有36%的氨基酸序列同源性。PVL屬于膜鉆孔毒素家族,Lusk-PV首先與PMNs細胞膜上的特異性高親和力強的受體結合,LukF-PV再與之結合形成二聚體,然后依次Luks-PV和LukF-PV結合最后形成環狀結構的雜聚體。此環狀結構內徑3 nm,外徑9 nm,分子量大約為200 ku,其中所含Luks-PV和LukF-PV的克分子比為1∶1,此雜聚體插入到PMNs細胞膜上,形成一個大約直徑2 nm的穿膜孔,此孔與細胞膜的平面垂直[5]。PVL通過誘導PMNs壞死或凋亡使細胞死亡,這依賴于PVL的濃度。在低濃度時,PVL特異地與尚未明確的細胞表面受體結合,產生較多的雜聚體孔道,有利于其他的PVL分子進入細胞,在線粒體外膜上建立孔道,破壞線粒體的內環境,激活caspase-9和caspase-3,釋放殺白細胞素C,誘導細胞凋亡[6]。而在高濃度時,PVL可能非特異地吸附到脂質雙層上,形成較大的八聚體孔道,當Lusk-PV與PMNs結合時,蛋白激酶A或C磷酸化Lusk-PV,激活Ca2+通道,Ca2+內流而產生白細胞介素和炎性介質,使PMNs溶解,釋放出氧化代謝產物和炎性介質引發一系列炎癥反應,嚴重者造成組織壞死。

PVL是由2個基因編碼,即 Luks-PV基因和LukF-PV基因,現已發現一些葡萄球菌噬菌體上有PVL基因,這些噬菌體可特異地插入到金葡菌染色體上,該位點與SCCmec插入位點不同,業已表明,PVL基因能為金葡菌提供SCCmec插入、生存所必需的適合結構,PVL基因可通過噬菌體轉導在細菌中傳播。約2%的醫院感染MRSA菌株攜帶 PVL基因[7],而大約3/4的社區MRSA(CA-MRSA)分離株攜帶PVL基因。

產PVL的金葡菌毒力非常強,常與皮膚、軟組織化膿性感染相關,特別是蜂窩組織炎、膿腫和癤腫等疾病,從這些疾病患者獲取的金葡菌PVL陽性率達50%～93%,引起甲溝炎的金葡球菌中PVL陽性率為13%。嚴重者可導致組織壞死和壞死性肺炎,而壞死性肺炎常暴發性起病,病死率很高。據報道,2005年12月英國由產PVL的MRSA引起的壞死性肺炎致使2例患者死亡。PVL陽性金葡菌感染者(平均年齡14.8歲)比PVL陰性感染者(平均年齡70歲)更年輕。Diep等[8]研究顯示,總共收集的671株金葡菌中,PVL陽性率為33.5%(225/671),其中約有1/3醫院感染 MRSA菌株和 2/3 CA-MRSA菌株的PVL陽性,而相應的MSSA菌株中的PVL陽性率卻低于7%。余方友等[9]研究顯示,195株金葡菌中PVL陽性率為13.3%,其中121株MRSA中 PVL基因陽性率為15.7%(19/121),74株MSSA中的PVL基因陽性率為9.3%(7/74)。許多研究結果表明MRSA菌株中PVL陽性率高于MSSA。目前MRSA耐藥性日趨嚴重且呈現多重耐藥現象,加之大多數患者具有基礎疾病,機體免疫力降低,若再感染了毒力強的產PVL的MRSA,其預后更加不良。由于MSSA的耐藥性不嚴重,所引起的感染往往被臨床忽視,可能會造成不良后果。

三、TSST-Ⅰ及 TSST-Ⅰ基因

金葡菌引起人類各種疾病,其中中毒性休克綜合征(toxic shock syndrome,TSS)因多器官受累,病死率高而備受重視。TSST-Ⅰ是由噬菌體Ⅰ群MSSA產生的外毒素,是一種多肽蛋白質,屬于致熱原性超抗原家族,它的超抗原活性很強,而分子量很小,約22 ku,DNA序列有708對堿基,585對堿基編碼194個氨基酸殘基,等電點為7.2。TSST-Ⅰ和金葡菌腸毒素A有34%氨基酸同源。TSST-Ⅰ具有2個亞單位(A、B)多肽鏈結構,其A 亞單位是毒素的活性中心,決定毒素的致病性與作用方式,多具酶的活性,通過作用于細胞內的靶點而發揮細胞毒效應,B單位能與靶細胞上的特異性受體結合,它決定毒素對宿主細胞的選擇親和性。TSST-Ⅰ不經抗原提呈細胞處理,而是以完整蛋白質的分子直接結合到細胞表面主要組織相容性復合物Ⅱ(MHCⅡ)類分子抗原結合槽的外側,形成的復合物與 T淋巴細胞抗原受體(TCR)的β鏈V區結合,經磷酯酰肌二醇二磷酸和環磷酸鳥苷信號傳導途徑激活T淋巴細胞使其活化、增殖,并釋放大量的炎性細胞因子如 IL-1、IL-2 、INF-γ、TNFα、TNFβ等引起強烈的免疫應答,最終導致炎癥失控和多器官的損害。由于TCR的β鏈V區僅存在有限的基因,核苷酸序列非常保守,同一個體內的許多T淋巴細胞可具有相同的β鏈V區成分,因此極低濃度TSST-Ⅰ即可激活大量的T淋巴細胞(可達全部T淋巴細胞的53%～0),而常規抗原只激活0.01%～0.1%的淋巴細胞[10]。TSST-Ⅰ還能直接損害庫普弗細胞,抑制內毒素脫顆粒反應,使內毒素在體內蓄積;擴大內毒素的致死效應105～106倍,2 μ g的內毒素進入人體可引起內毒素休克,而在TSS患者僅需10-12g水平的內毒素即可發生嚴重的低血壓和休克,這稱之為級聯效應;TSST-Ⅰ還可增加血管透性,抑制B淋巴細胞,減少特異性抗體產生等途徑介導休克。

TSST-Ⅰ由 TSST-Ⅰ基因編碼,位于細菌染色體上,全長 702 bp,編碼 234個氨基酸,當金葡菌攜帶的 TSST-Ⅰ基因被激活時,即產生 TSST-Ⅰ毒素,該基因僅存在于5%～15%的金葡菌的菌株之中,其他在人體內無害生存的菌株不具有 TSST-Ⅰ基因,該基因由一個被稱為附屬基因調節器的整體系統來控制,該系統控制很多分泌蛋白的產生,而某種蛋白在其細胞外濃度達到一定水平時觸發TSST-Ⅰ基因活性,這就是TSST-Ⅰ毒素的產生受細菌密度影響的原因。

TSST-Ⅰ可引起機體發熱、脫屑性皮疹及休克,并增加對內毒素的敏感性,感染產毒菌株后可引起機體多個器官系統的功能紊亂或 TSS病,病死率高。20世紀80年代早期TSS多見于月經期使用衛生棉塞或衛生栓的婦女中,因而提名為月經相關性TSS。現在TSS不僅在年輕月經期婦女中發生,而且非月經期的婦女、男性及兒童也可發病。Recsei[11]等首先發現了非月經性TSS即流行性感冒相關性TSS,所致感染雖然輕微,無明顯發熱,但在兒童中死亡率極高可達90%。20世紀80年代以后的文獻報道,燒傷、鼻部手術后、膿腫、皮膚移植、外科手術發生感染后也能并發TSS。王慎[12]等對20例具有典型新生兒出疹病的患兒觀察研究,發現患兒體內均有MRSA寄殖,并且都產生TSST-Ⅰ,但臨床癥狀與TSS不符,因此命名為新生兒中毒性休克綜合征樣出疹病。國外曾有人報道,臨床MRSA感染菌株中約50%伴有腸毒素和(或)TSST-Ⅰ產生,其中絕大多數為耐藥菌株。王敏等[13]研究顯示,共收集的84株金葡菌中,TSS T-Ⅰ基因陽性率為19.05%(16/84)。祁偉等[14]研究結果顯示,總共收集的112株 MSSA中 TSST-Ⅰ基因陽性率為20.5%(23/112),MSSA TSS T-Ⅰ基因陽性與TSST-Ⅰ表達兩者之間的一致性大于99%。不僅引起TSS的金葡菌產TSST-Ⅰ,而且引起其他疾病的金葡菌株也能產TSST-Ⅰ,這些產TSST-Ⅰ的金葡菌株無疑對患者特別是對那些免疫功能缺陷不能產生特異性抗體者構成了潛在的威脅。

目前MRSA耐藥性日趨嚴重且呈現多重耐藥現象,加之大多數患者具有基礎疾病,機體免疫力降低,若再感染了毒力強的產 PVL和 TSST-Ⅰ的MRSA,增加了臨床治療的難度,其預后更加不良;金葡菌的耐藥性相對不嚴重,所引起的感染往往被臨床忽視,可能會造成不良后果。

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