溶酶體自噬途徑降解α－synuclein蛋白作用研究

王潤青 趙 杰△ 張曉曼 劉 威 趙松耀 秦曉明 趙美英 孟宏音

1）鄭州市中心醫院神經內科 鄭州 450007 2）鄭州市第一人民醫院神經內科 鄭州 450006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是當今最為廣泛的神經退行性疾病之一，在全世界40歲以上人口中，有超過0.1%的人受到該疾病影響。20世紀60～80年代，生物學研究主要集中在核酸及蛋白質的翻譯上，蛋白質的降解則被人們忽視，誤認為是一個非特異的終端過程。近年來，隨著對細胞內蛋白降解途徑的深入研究發現蛋白降解是一個復雜、縝密的調控過程，是細胞調控的重要機制。α－synuclein蛋白降解也不例外，眾多研究表明蛋白酶體抑制劑可誘導多巴胺能神經元細胞死亡和細胞內α－synuclein蛋白聚集包涵體形成，證明蛋白酶體通路影響α－synuclein蛋白降解，但作為細胞內另外一條蛋白降解途徑——溶酶體途徑對α－synuclein蛋白降解的影響研究比較匱乏。本研究通過觀察溶酶體抑制劑E64對α－synuclein蛋白聚集、降解的影響，以揭示α－synuclein蛋白可通過溶酶體途徑降解，為明確PD發病機制和尋找新的治療方法提供實驗依據和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞：大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系（PC12細胞）由武漢大學典型培養物儲藏中心提供。

1.1.2 實驗試劑：DMEM 培養基、小牛血清、馬血清購自Gilbco公司，鼠源神經生長因子（NGF）購自廈門北大之路生物工程有限公司，E64、硫磺素S、二甲基亞砜（DMSO）、魚藤酮（Rotenone）購于美國Sigma公司，山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗體和兔抗大鼠LAMP2抗體均購自Santa Cruz公司，TRITC和FITC標記熒光二抗均購自北京中杉金橋生物試劑有限公司，其余試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：PC12細胞置于DMEM 培養基中，內含10%（體積分數）滅活小牛血清及5%的馬血清、青霉素100 U／mL、鏈霉素100U／mL，于5%（體積分數）CO2、37℃培養箱內進行培養，隔天換液。藥物處理前1周用NGF（終濃度為50ng／mL）誘導PC12細胞神經元樣分化，處理當天將Rotenone配制成1mmol／L的母液，E64配成10mmol／L的 母 液，Rotenone、E64 終 濃 度 分 別 為 100nmol／L、200 mmol／L，用于以下實驗。

1.2.2 免疫熒光細胞化學方法檢測胞質內α－synuclein蛋白和硫磺素陽性包涵體：本實驗分組如下：①正常組即未加任何藥物組。②Rotenone處理48h組。③撤除Rotenone繼續自然孵育48h組，此組作為對照組。④撤除Rotenone后加入E64繼續孵育48h組。具體如下：將細胞接種到鋪有蓋玻片的24孔板內，待進入對數生長期后加入100nmol／L Rotenone處理48h后再換液撤除Rotenone并加入終濃度為200μmol／L的E64，繼續孵育48h后取出蓋玻片，常規處理后用冷丙酮／無水乙醇（體積比1∶1混合）室溫固定細胞10 min；加入2‰Triton X－100（體積分數）的PBS溶液室溫作用20min；用0.1%硫磺素S孵育10min，之后移入80%的酒精分化5min，振蕩洗滌入3%牛血清白蛋白（BSA）室溫作用30min；吸出多余液體，加入山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗體（1∶100），4°C孵育過夜，陰性對照組用PBS代替一抗；加入TRITC標記的兔抗山羊熒光二抗（1∶100）室溫避光孵育90min；anti－fade處理。每步后皆用PBS洗滌5min×3。熒光顯微鏡下及其相連的計算機圖像處理系統中觀察胞質內α－synuclein蛋白和硫磺素S陽性包涵體的形成。用計算機圖像處理系統拍照和圖片處理。每次每組實驗設四個復孔，每組實驗重復3次。雙陽性包涵體的細胞計數是在顯微鏡下以每孔中心十字為界，隨機選取多個視野，每組觀察10個視野，計數含有雙陽性包涵體的細胞百分數（細胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色陽性包涵體細胞個數／每個視野的細胞總數×100% ）。

1.3 統計學處理 所有數據應用SPSS 12.0統計軟件分析，數據結果采用均數±標準差（）表示，各實驗組與對照組均數差異顯著性用Dunnett法，多組間比較先行方差齊性檢驗，方差齊者行方差分析；方差不齊者行成組秩和檢驗，組間比較用Student－Newman－Keuls法檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

免疫熒光細胞化學方法檢測藥物Rotenone及撤除Rotenone后E64處理PC12細胞48h后胞質內α－synuclein蛋白和硫磺素S陽性包涵體情況：正常組PC12細胞中僅有少數細胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色雙陽性的細胞包涵體（3.26±0.32）%；經100nmol／L Rotenone處理48 h后含有雙陽性包涵體的數目明顯增加（21.15±1.58）%，撤除Rotenone后再培養48h后包涵體數目又明顯減少（7.23±0.75）%，上述三組相比差異具有統計學意義（P＜0.05），說明α－synuclein蛋白模型成功建立。撤除Rotenone后再經終濃度為200mmol／L E64處理48h后，含有陽性包涵體的細胞數目為：（15.36±0.85）%，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

α－synuclein蛋白是路易小體的重要組分，與帕金森病發病機制密切相關，目前研究表明α－synuclein蛋白聚集主要與其降解障礙有關。但是蛋白酶體或是溶酶體降解α－synuclein，或者是兩者的共同作用尚不十分清楚。最近有研究顯示α－synuclein蛋白存在蛋白酶體和溶酶體兩條降解途徑［1－2］。最近又有研究顯示體內存在α－synuclein蛋白酶體降解途徑和溶酶體降解途徑的分子開關CHIP［3］。

目前研究已經明確魚藤酮處理PC12細胞后α－synuclein蛋白增加且可以出現α－synuclein蛋白聚集，而去除魚藤酮后細胞內聚集物又可消失［4］。本試驗利用魚藤酮這一特性成功建立α－synuclein蛋白模型。我們研究發現應用溶酶體途徑抑制劑E64作用于魚藤酮處理后的PC12細胞顯示：E64處理組出現α－synuclein明顯聚集且包涵體形成；依此分析αsynuclein蛋白可通過溶酶體途徑降解，另有研究顯示α－synuclein聚集后具有細胞毒性［5］，Ana Maria Cuervo等研究發現α－synuclein形成蛋白聚集體后，就會阻斷分子介導的自吞噬途徑，使溶酶體無法降解其他酶解底物，從而干擾其正常的細胞清除功能，并導致自吞噬作用的補償性激活［6］。因此我們推測自噬也可能參與了細胞的死亡過程。但到底是什么原因導致了神經元最后的死亡，眾多研究表明，由α－synuclein積聚所形成的包涵體在一定程度上通過細胞凋亡途徑而導致多巴胺能神經元死亡。激活自噬加速新合成的蛋白聚集物清除已經得到實驗證實［2，7］。然而，隨著疾病的進展，蛋白聚集物越來越多，它們對溶酶體蛋白酶降解的敏感性下降或者溶酶體本身功能的下降，自噬的持續性激活將導致細胞最終發生自噬性程序性細胞死亡。由此推測細胞死亡的原因可能也與細胞溶酶體功能的下降引起蛋白聚集和自噬的持續性激活有關。而且不可否認的是溶酶體功能確實有隨年齡增長而逐漸下降的趨勢。巧合的是有一種早發性家族性PD伴有遺傳性溶酶體貯積癥［8］，有溶酶體貯積癥患者伴有帕金森綜合征［9］。另有研究發現α－synuclein蛋白聚集也影響溶酶體功能，神經元中變異α－synuclein表達引起溶酶體功能的失調和泛素依賴性的蛋白水解系統的破壞［10］。說明溶酶體功能下降與α－synuclein蛋白聚集之間相互影響，相互促進，形成惡性循環。

目前研究越來越多的證據證明程序性細胞死亡不僅僅局限于凋亡，自噬為主的II型程序性死亡（PCD）也占據了重要的位置。凋亡與自噬／溶酶體途徑引起的細胞死亡之間并不是完全各自獨立，而有著大量的信號交叉。因此可以推測可能凋亡和自噬共同參與了多巴胺神經元的變性死亡。激活自噬可加速細胞內蛋白聚合物的清除，而這種蛋白聚合物的存在是神經變性性疾病的典型特點之一［11－12］，但過度自噬又引起II型PCD。

本研究應用農業中廣泛使用的殺蟲劑之一魚藤酮建立α－synuclein蛋白模型，較以往研究者用轉染α－synuclein基因建立α－synuclein蛋白過表達模型更接近于體內真實情況，某些α－synuclein基因突變可引起家族性PD已得到證實，本研究把引起PD遺傳因素和環境因素有機結合了起來。另本研究結果顯示α－synuclein蛋白可通過溶酶體途徑降解，溶酶體途徑根據底物進入溶酶體的方式不同分為3種類型：微自噬（microautophgy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侶介導的自噬（chaperone－mediated autophagy，CMA）。我們下一步將對α－synuclein蛋白溶酶體具體降解途徑及自噬的調控機制進一步深入研究。經過上述討論及結合我們的試驗結果，提示凋亡和自噬可能共同參與了DA能神經元的變性死亡。深入了解DA能神經元的II型PCD機制，將為PD的治療和預防及發病機制的闡明提供一個新的思路。

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