microRNA 與肺癌

牛曉曉 綜述 王秦秦 審校

1 microRNA概述

1.1 microRNA的形成過程及作用機制 microRNA被認為是從DNA轉錄、不被翻譯但能調控其它基因表達的分子。microRNA的初始轉錄產物-初微microRNA（pri-miRNA）在細胞核內被核酸酶Drosha加工成miRNA前體（premiRNA）[4]，然后經Ran-GTP及其受體Exportin-5轉運出細胞核[5,6]。60 nt-90 nt的pre-miRNA形成莖環的結構，細胞之中的RNaseIII-Dicer酶將成熟的miRNA從發夾狀的premiRNA的莖區域中剪切出來，最后成熟的miRNA裝配進RNP形成RNA誘導的沉默復合體（RNA induced silencing complex, RISC），執行RNAi相關的基因沉默[7]。

microRNA可以指導效應復合物RISC通過兩種不同的機制即mRNA剪切和翻譯抑制下調靶基因的表達。根據目前公認的觀點，microRNA與其靶基因的互補程度決定了它以何種機制沉默靶基因。一旦microRNA組裝進入效應復合物RISC，當其與靶mRNA部分互補特別是與3′UTR的堿基配對后可阻抑翻譯；如果其與靶mRNA完全互補，mRNA可被類似siRNA的機制降解。

1.2 microRNA的命名原則 研究人員[8,9]對發現的microRNA制定了如下命名規則：①microRNA簡寫成miR，再根據其被克隆的先后順序加上阿拉伯數字，如miR-21；②高度同源的microRNA在數字后面加上英文小寫字母（a、b、c等），如miR-199a和miR-199b；③由不同染色體上的DNA序列轉錄加工而成的具有相同成熟體序列的microRNA，則在后面加上阿拉伯數字以區分，如miR-199a-1和miR-199a-2；④如果一個前體的兩個臂分別加工產生microRNA，則根據克隆實驗在表達水平較低的miRNA后面加“*”，如miR-199a和miR-199a*，或進行如下命名，如：miR-142-5p（也可命名為miR-142-s，表示從5′端的臂上加工而來）；⑤將物種縮寫置于microRNA之前，如has-miR-199；⑥確定命名規則之前發現的microRNA，如let-7等保留原來的名字。

1.3 microRNA和siRNA 小RNA分子是非編碼的RNA分子，控制著真核細胞的許多功能，影響基因的表達、細胞周期和個體發育等多種行為。小RNA主要包括小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）和微RNA（microRNA）。

siRNA是一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程也就是RNA干擾（RNA interference, RNAi）。microRNA與siRNA并不相同，但又密切相關；他們之間很容易混淆，有很多共同點也有許多不同點。

主要區別點包括： ①來源不同：siRNA通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后產生外源基因進入細胞，而microRNA是內源性的，是一種非編碼的RNA，由miRNA基因表達出最初的pri-miRNA分子加工后形成；②作用機制不同：siRNA滲入RISC中，引導復合物與miRNA完全互補，通過其自身的解旋酶活性解開siRNA，通過反義siRNA鏈識別目的mRNA，通過內切酶活性切割目的片段，再經細胞外切酶進一步降解目的片段。siRNA也可以抑制具有短片段互補mRNA的翻譯。microRNA通過與miRNP核蛋白體復合物結合，識別靶基因mRNA，并與之部分互補，從而抑制翻譯；③生物學意義不同：siRNA不參與生物發育，是RNAi的產物，原始作用是抑制轉座子活性與抵御病毒感染。microRNA主要在發育過程中發揮作用，調節內源性基因的表達，具有高度保守性、時序性和組織特異性。

1.4 microRNA表達譜高通量分析方法 2002年首次報道了microRNA分子與癌癥的關系，研究[10]發現癌細胞存在特異的microRNA缺失或表達下調。接著一系列的報道指出在各種癌癥中許多microRNA分子的表達都有明顯降低，但也有一部分microRNA分子表達是上調的。鑒于這些研究結果，科學家們試圖建立起不同癌癥的microRNA表達譜庫，以期應用于臨床診斷。

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迄今為止，尋找microRNA分子表達模式的高效率、高通量方法對于研究microRNA分子功能與癌癥的關系是非常重要的。目前常用的方法有microRNA克隆、微陣列分析法（microarray analysis）、微珠表達分析和其它方法。由于microRNA分子片段小，在進行高通量表達分析時需要特殊考慮，另外microRNA家族成員序列高度相似性的存在也使問題變得更復雜，因此微陣列的運用已成為最主要的方法。

微陣列分析法實際上是一種微型生物傳感器，在不同的基質表面有序地點陣排列了一系列生物分子，固定在每一點陣上的分子都是已知的。在相同條件下，點陣上的分子與其配體分子反應，反應結果用核素、熒光、化學發光或酶標法顯示，再通過計算機軟件分析，綜合成可讀總信息，實現對化合物、蛋白質、核酸、細胞或其它生物組分準確、快速、高通量地篩選或檢測。microRNA的微陣列分析法目前已廣泛用于特異組織或細胞內microRNA表達譜的研究。但對microRNA表達特征的研究是間接的，在分析過程中仍存在特異性和敏感度不高等缺點，因此結果有一定的假陽性，需要輔助其它更為準確的表達研究方法加以驗證，如PAGE/Northern blot等[11]。

2 microRNA和肺癌

Volinia等對123例肺癌組織與123例正常肺組織進行了microRNA的表達差異比較研究，發現有38種microRNA存在表達差異，如let-7家族、miR-16-2、miR-21、miR-191、miR-17-5p以及miR-155等。Yanaihara等利用microRNA基因芯片分析法，對104例非小細胞肺癌組織與正常肺組織研究發現，有43種microRNA有明顯的表達差異，15種microRNA發生上調及28種microRNA發生下調。這些發現[12]均為microRNA在肺癌中的研究奠定了基礎。

2.1 let-7與肺癌 let-7最早在線蟲中發現，它調控細胞的分化和增殖的時序，成熟的let-7序列在線蟲和人類中是保守的。目前發現人類let-7家族有12種，包括let-7a-1 、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、 let-7i 和miR-98。人類let-7家族成員大多定位于9、11、22號染色體上。

Takamizswa[13]在2004年通過Northern blot分析了20個人類肺癌細胞株和2個永久人類正常肺上皮細胞株，發現在正常肺上皮細胞株中易檢測到成熟let-7，與正常肺組織表達水平相似，60%肺癌細胞株let-7表達水平明顯下降。同樣在143例原發性肺癌組織標本中也發現let-7表達下調，其中表達水平下降＞80%的病例占44%，說明let-7在肺癌體內和體外表達均下調。在肺癌細胞系中，let-7家族的過表達能夠抑制細胞的增殖、分化和侵襲轉移。

let-7的靶基因包括Ras家族、高遷移組A蛋白（HMGA2）、c-Myc、CDC25A、CDK6和Cyclin D2。其中最典型的是促進細胞增殖的Ras家族和參與細胞增殖分化的HMGA2。Ras原癌基因是Ras基因家族成員之一，屬于膜相關的鳥苷三磷酸酶信號蛋白，可調節細胞生長和分化。HMGA2是與染色體結合的非組蛋白，通過抑制核苷酸切除修復途徑引起基因不穩定，促進腫瘤的發展。2005年Johnson等[14]證實肺癌中let-7的降低使其調控的靶點Ras基因過表達。let-7在肺癌的低表達和Ras的高表達提示microRNA可以作為抑癌基因。研究發現HMGA2在一些惡性腫瘤中如乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌表達增高，對惡性腫瘤的生長、分化和轉移起重要作用。Mayr等研究發現let-7主要依賴于HMGA2的3′UTR，由于染色體移位毀壞了HMGA2的3′UTR結構，無法與let-7結合而失去對let-7的抑制作用，引起以不依賴支持物生長為特征的致瘤性轉化。

2.2 microRNA-29家族與肺癌 目前認為腫瘤的發生和發展同時受遺傳學和表觀遺傳學的調控。表觀遺傳學只影響表型不改變基因型，包括DNA甲基化改變、組蛋白修飾和非編碼RNA誘導的改變。基因組甲基化的改變受DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase, DNMT）的調控，DNMT催化S腺苷甲硫氨酸的甲基基團轉移至胞嘧啶環的5′端。DNMT3A和DNMT3B在肺癌中也經常出現上調，且DNMT3A和DNMT3B出現上調的肺癌預后差。一些miRNA在肺癌中表達下調，其中miR-29家族（miR-29a、miR29b和miR29c）與DNMT3A和DNMT3B的3′UTR互補。Fabbri等[15]將DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的互補位點克隆至熒光素酶基因的3′UTR中，然后與miR-29a、miR29b和miR29c共轉染入肺癌A549細胞。結果顯示總DNA甲基化水平與對照組相比有明顯下降，轉染48 h后下降30%，72 h后下降40%，H1299細胞也有類似情況。因此在肺癌組織中miR-29的表達與DNMT3A和DNMT3B呈負相關，miR-29直接靶定DNMT3A和DNMT3B。Fabbri等還發現在肺癌細胞株中表達miR-29可以修復異常的DNA甲基化，誘導甲基化相關沉默腫瘤抑制基因的重新表達，抑制腫瘤生長。Rajewsky[16]也認為DNMT1、DNMT3A和DNMT3B可能都是miRNA潛在的靶點。

2.3 miR-34家族與肺癌 p53是經典的抑癌基因，在多種腫瘤相關應激信號的刺激下被激活，引起細胞周期阻滯、促進DNA修復、誘導細胞衰老死亡等生物學效應。近期研究[17,18]發現miR-34家族作為p53靶基因參與傳統的p53抑癌網絡。

在脊椎動物中，miR-34家族有3個成員，即miR-34a、miR-34b和miR-34c。人miR-34a位于初始轉錄子的第二外顯子，而miR-34b和miR-34c分別位于同一初始轉錄子的第一內含子和第二外顯子[19,20]。 Xi等[21]通過全基因組掃描分析，發現miRNA中超過46%的啟動子區有p53潛在的結合位點，說明這些miRNA有可能直接受野生型p53的調控。研究還發現miR-34家族成員與p53的狀態明顯相關，只有野生型p53能明顯誘導miR-34的活化。在電離輻射誘導DNA損傷后，小鼠不同臟器組織中成熟的miR-34以p53依賴的方式被激活，在阿霉素誘導p53活化后，miR-34a也以依賴p53的方式明顯升高，而在DOX誘導下，肺癌細胞中miR-34a的表達水平升高300多倍。miR-34b在超過90%的非小細胞肺癌中表達下降[22]。

2.4 miR-17-92與肺癌的關系 miR-17-92是由7個microRNA（miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b-1和miR-92-1）組成的表達簇，是一個microRNA的多順反子，位于染色體13q31。與正常組織相比，miR-17-92族在肺癌中表達水平明顯升高，以大多數進展期的小細胞肺癌為甚[23]。miR-17-92族可加快肺癌細胞的生長，但其在肺癌發生發展中的作用機制尚不清楚，預測可能是通過抑制兩個腫瘤抑制基因PTEN和Rb2而發揮其致癌作用。O'Donnell[24]研究發現miR-17-92族與小細胞肺癌中多發性高表達的致癌基因c-Myc相關，Myc基因過表達引起了miR-17-92的高表達。此外，近年來腫瘤microRNA表達譜的研究[25]也涉及到miR-17-92家族過表達的研究，表明在肺癌中miR-17-92家族的成員呈廣泛過表達趨勢。

2.5 Dicer酶與肺癌 Dicer是RNaseIII家族的成員，在進化上高度保守。Dicer的N端是1個RNA解旋酶結構域，隨后是1個PAZ結構域，在C端是2個RNaseIII結構域和1個雙鏈RNA結合結構域（double-stranded RNA binding domain,dsRBD）[26]。Dicer的作用見microRNA形成過程所述。

有研究[27]表明在肺腺癌的前期病變即不典型腺瘤樣增生及細支氣管肺泡癌中Dicer呈短暫性高表達。免疫組化和蛋白質印跡分析表明Dicer在肺鱗癌中表達高于肺腺癌，而在進展期肺腺癌中表達下調。

2.6 miR-128b和miR-7與肺癌 研究顯示，約43%-89%非小細胞肺癌患者的肺組織標本中檢測到表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）表達或高表達。大量證據[28]表明EGFR過度表達和/或激活與非小細胞肺癌患者生存期短、預后差、放化療敏感性下降密切相關。胡雪君等[29]檢測73例青年和65例老年非小細胞肺癌標本EGFR的表達，發現EGFR在非小細胞肺癌標本中的陽性表達率為51.4%。

鑒于EGFR在肺癌中的調控作用，研究人員將注意力轉移到研究EGFR與microRNA的關系上來。Weiss等[30]挑選了miR-128b來進行此研究，因為其定位于肺癌缺失的3p22染色體上，結果顯示在非小細胞肺癌細胞系中miR-128b可與EGFR的3′UTR端結合從而影響蛋白質的翻譯。研究人員[31]發現在肺癌細胞系中miR-7也可以下調EGFR及蛋白的表達。

2.7 miR-107和miR-185與肺癌 細胞周期分為4期：DNA合成前期即G1期、DNA合成期即S期、DNA合成后期即G2期和細胞分裂期即M期。細胞周期調控的理論與腫瘤發生發展的關系是一個十分重要的研究領域。研究表明細胞的增殖、分化、衰老和凋亡均是細胞周期依賴性的，腫瘤細胞同樣也是周期依賴性的。

2008年Kumar等[32]在研究多元化非小細胞肺癌小鼠模型K-RasG12D時發現，let-7g可抑制肺癌細胞的生長，使肺癌細胞周期停止或死亡。Takahashi等[33]將miR-107和miR-185轉染至肺癌細胞中，流式細胞儀分析顯示這些miRNA可使H1299細胞和A549細胞停滯在G1期，其抑制作用比let-7更強。他們定位于人類肺癌的染色體易變區域，是新的調控人類惡性腫瘤細胞的周期調節因子。

2.8 miR-221、miR-222與肺癌 腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）是近年發現的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）家族成員，與死亡受體結合后可特異性地誘導腫瘤細胞和惡性轉化細胞凋亡[34]。Garofalo等[35]與Miller等[36]篩選出對TRAIL敏感性不同的4個非小細胞肺癌細胞系，通過比較它們在microRNA表達譜上的區別，最終證實高表達的miR-221及miR-222通過下調P27kip1抑制了TRAIL介導的細胞凋亡信號通路。PTEN是重要的抑癌基因之一，可以調節細胞生長和凋亡。Michela等[37]研究證實肺癌細胞系中miR-221及miR-222過表達，通過靶向結合PTEN 3′UTR端抑制PTEN的表達從而增加了肺癌的發生率。少量研究表明基質金屬蛋白酶（ matrix metalloproteinases, MMP）抑制因子TIMP3也是miR-221及miR-222下游靶標，其通過抑制TIMP3的表達而激活MMP，以增強肺癌的侵襲能力。

2.9 microRNA與肺癌的診斷、治療及預后 microRNA的表達模式與人類腫瘤的診斷、分期、進展、預后等密切相關，microRNA甚至可以直接作為癌癥基因治療的靶標。

2.9.1 microRNA與肺癌的診斷 許多研究表明，肺癌組織與正常肺組織的microRNA表達譜有明顯的差別，越來越多的研究者將microRNA作為腫瘤的生物學標志物來探討。Mitchell等[38]研究發現，在血清中可以有效分離出microRNA，并且microRNA在血清中以穩定的形式存在，無論是高溫、驟冷還是強酸強堿條件下都不會被降解，這就說明血清中microRNA可以作為穩定的生物學標志物來檢測癌癥。Chen等[39]采用Solex測序方法對健康人血清和非小細胞肺癌患者血清中的小分子RNA進行測序分析。結果顯示，肺癌血清與健康人血清相比microRNA表達譜明顯不同，肺癌患者血清中有28種正常血清中存在的microRNA缺失，但是檢測出了63種在正常血清中沒有的microRNA分子。目前，對循環microRNA與腫瘤的關系研究還處于起步階段，但是這已為腫瘤的無創診斷開辟了一條新的道路。此外，研究[40]還發現在福爾馬林固定過的石蠟包埋組織中（甚至保存10年的標本）能夠有效地檢測出microRNA分子，具有廣泛的臨床應用前景。

2.9.2 microRNA與肺癌治療 在肺癌治療方面，microRNA還沒有得到應用，但是一些microRNA可以作為抑癌基因發揮作用，例如Trang等[41]通過建立小鼠非小細胞肺癌模型將let-7導入小鼠體內，結果顯示let-7可以有效抑制腫瘤的生長，剔除let-7可促進小鼠肺癌的發生；盡管接受let-7治療小鼠的腫瘤沒有消失，但是66%的腫瘤均在縮小。對于抑癌基因的microRNA治療策略是重新表達這些下調基因，理論上可以消退腫瘤。因此針對microRNA開發的microRNA相關藥物不會產生如siRNA引起的完全基因表達抑制，而更接近于正常生理調節作用。

有資料認為90%的腫瘤患者死亡與腫瘤的抗藥性有關，大量研究表明microRNA與腫瘤發生發展相關，也有少量研究揭示microRNA與腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度相關。microRNA的突變、異常表達和異常加工均會影響microRNA的正常功能，導致靶基因的蛋白表達水平異常，如果此類靶基因與腫瘤細胞對藥物的反應程度相關，將改變腫瘤細胞的藥物敏感度。2007年Bertino等[42]提出了“microRNA的藥物基因組學”概念，指出通過研究microRNA及microRNA的突變如何干擾microRNA的正常功能進而改變病人對藥物的反應程度，最終可找出某些特定的microRNA用以指導病人的個性化用藥。Shin等[43]發現A549細胞接受20 Gy、40 Gy放射后microRNA分別有4種、10種的改變，這些變化的microRNA與放射引起的細胞凋亡、細胞周期調控等有關，這就提示在放射治療學中microRNA也有潛在應用價值。

2.9.3 microRNA與肺癌的預后 Yanaihara等[44]對104例非小細胞肺癌（65例腺癌、39例鱗癌，65例I期、17例II期、22例III-IV期）術后患者進行了研究，在腺癌患者中miR-155、miR-17-3p、miR-106a、miR-93高表達者和let-7a-2、miR-145、let-7b低表達者預后差。其中miR-155和let-7a-2的表達水平和患者的生存率有著密切的關系。有研究者[45]對112例非小細胞肺癌患者進行了檢測，研究人員通過Cox模型和風險評分發現了5個預測非小細胞肺癌治療效果的microRNA信號。帶有這些microRNA信號的高風險基數的病人相對于低風險基數的病人，治療效果較差。因此研究人員認為這些microRNA信號是非小細胞肺癌患者復發和存活的獨立預測因子。

3 展望

隨著基因芯片、RT-PCR和Northern blot等各種技術方法的應用和完善，檢測microRNA的表達日益精確可靠，為肺癌的研究及基因診斷開辟了新的途徑，也為肺癌的發生機制研究以及相關的生物治療策略提供了新的視角。但是研究結果同時顯示了microRNA作用的復雜性，如單個microRNA可以同時調控多個靶基因，而多個microRNA也可同時調控一個靶基因的表達，而且這些調控具有一定的特異性，給全面研究microRNA的功能以及構建microRNA的調控網絡帶來了困難。相信這些困難的解決將有利于進一步理解microRNA在生物發展中的作用，并為利用microRNA進行臨床診斷和治療提供新的依據。