支氣管肺泡灌洗在肺癌診斷方面的研究現(xiàn)狀及展望

丁衛(wèi)民 綜述 岳文濤 傅瑜 審校

支氣管肺癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，其發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，每年全世界約100萬(wàn)人死于肺癌。肺癌的早期診斷對(duì)提高患者5年生存率至關(guān)重要。傳統(tǒng)胸部X線、CT影像學(xué)及痰液細(xì)胞學(xué)等檢查在肺癌早期定性診斷方面具有一定的局限性。隨著可彎曲支氣管鏡介入性檢查手段在臨床上被廣泛采用，支氣管鏡檢查逐漸成為肺癌早期診斷的重要手段。

常規(guī)支氣鏡檢查包括經(jīng)支氣管鉗夾活檢（forceps biopsy, FB）、刷檢（brush biopsy, BB）及經(jīng)支氣管針吸活檢（transbronchial needle aspiration biopsy, TBNAB）等，鉗夾活檢、刷檢可分別使74%、59%左右的肺癌明確診斷，但仍有部分肺癌，特別是周圍型肺癌診斷較為困難[1,2]。

支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）是經(jīng)支氣管鏡向局部支氣管肺泡注入生理鹽水，隨即進(jìn)行抽吸而獲取支氣管肺泡表面被覆液與灌入生理鹽水混合液的一種方法。BAL可通過(guò)支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）細(xì)胞學(xué)、腫瘤標(biāo)志物等檢測(cè)解決常規(guī)支氣管鏡未能見(jiàn)到的異常肺部病變的診斷，特別是周圍性、原發(fā)性或繼發(fā)性惡性腫瘤等，往往被稱為“液相活檢”[3]。

1 細(xì)胞學(xué)（cytology）

1.1 病理細(xì)胞學(xué)（pathocytology） BAL時(shí)使用生理鹽水灌注到更遠(yuǎn)端的細(xì)支氣管肺泡，能大面積沖洗和收集腫瘤脫落細(xì)胞，進(jìn)行BALF病理細(xì)胞學(xué)檢查，可以提高周圍性肺癌患者癌細(xì)胞檢出率。為探討支氣管沖洗（bronchial washing, BW）在中心型肺癌及周圍型肺癌診斷方面的價(jià)值，Lee等[4,5]進(jìn)行了研究，結(jié)果提示中心型可視腫瘤患者行BW，支氣管沖洗液（bronchial washing fluid, BWF）腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)率為55.8%-57.3%，F(xiàn)B未能明確診斷的6例患者卻經(jīng)BW發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞而確診；周圍型不可視腫瘤患者行BW，腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)率為20%。隨后Poletti等[6]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)BALF標(biāo)本腺癌檢出率為80%。BALF檢查被證明是診斷原發(fā)性、周圍性肺部惡性腫瘤有價(jià)值的方法，并且腫瘤細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)率與肺癌組織類型、大小、位置等有關(guān)[5]。

1.2 淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子（lymphocyte & cytokine） 肺部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體全身或局部免疫低下、腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸有關(guān)，與細(xì)胞因子水平關(guān)系密切。

為分析肺癌BALF中細(xì)胞成分概況與變化從而了解肺癌局部免疫反應(yīng)， Domaga?a-Kulawik等[7]借助過(guò)氧化物免疫酶標(biāo)記法應(yīng)用CD3+等單克隆抗體對(duì)周圍型肺癌患者及健康對(duì)照者進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照者相比，肺癌患者BALF中巨噬細(xì)胞（60%）明顯降低，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞（24%、13%）明顯增多，T淋巴細(xì)胞（86%）明顯上升，CD4+/CD8+相對(duì)下降。隨后，研究小組[8]又應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法對(duì)38例原發(fā)性肺癌及23例健康志愿者的腫瘤生長(zhǎng)因子-β1（tumor growth factor-β1, TGF-β1）進(jìn)行了檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者BALF中TGF-β1濃度明顯高于對(duì)照組，證實(shí)TGF-β1參與原發(fā)性肺癌的局部免疫反應(yīng)，具有抑制宿主抗腫瘤免疫作用。

Katsoulis等[9]采用單克隆抗體方法對(duì)42例原發(fā)性肺癌患者及非惡性腫瘤患者的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與血清中結(jié)果相比，肺癌患者BALF中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白介素-1α（interleukin-1α, IL-1α）及白介素-6（interleukin-6, IL-6）增高（P=0.02），但對(duì)照組血及BALF中IL-6水平無(wú)明顯差異（P＜0.05）。

Ohta等[10]應(yīng)用ELISA法對(duì)41例原發(fā)性肺癌、7例非肺癌患者的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothial growth factor, VEGF）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肺癌患者BALF標(biāo)本中VEGF濃度明顯高于非肺癌患者（P=0.047），BALF標(biāo)本中VEGF濃度均高于血漿，VEGF濃度不受性別、年齡、腫瘤部位及組織類型影響，而VEGF白蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后的相對(duì)濃度即VEGF指數(shù)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，I期肺癌VEGF指數(shù)明顯高于IV期（P=0.030 8）。檢測(cè)BALF中的VEGF可了解氣管內(nèi)腫瘤血管生長(zhǎng)信息，從而推斷腫瘤發(fā)生發(fā)展。

1.3 凋亡能力（apoptotic capacity） 肺癌的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞異常增殖和凋亡障礙有關(guān)。Zunic等[11]借助半定量細(xì)胞化學(xué)評(píng)分及指數(shù)法，應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的d-UTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TdT-mediated dUTP nick end labelling, TUNEL），對(duì)非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）患者、抽煙及不抽煙的健康志愿者三組對(duì)象的肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生或清除凋亡細(xì)胞的能力進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示與不抽煙者（218.29±56.24）相比，抽煙者肺組織凋亡能力明顯增強(qiáng)（289.55±50.77），與健康志愿者相比NSCLC患者肺組織凋亡能力明顯減弱（150.30±40.61, P＜0.05）。

2 腫瘤標(biāo)志物（tumor marker）

支氣管肺泡上皮發(fā)生癌變時(shí)，可以產(chǎn)生或釋放出某些腫瘤相關(guān)物質(zhì)（異常基因及其產(chǎn)物）即腫瘤標(biāo)志物于血清及支氣管肺泡表面被覆液中。腫瘤標(biāo)志物的研究與應(yīng)用對(duì)腫瘤診斷及臨床治療開(kāi)創(chuàng)了新領(lǐng)域。目前所應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物主要有胚胎類抗原、糖類抗原、細(xì)胞角蛋白、腫瘤相關(guān)的酶和激素、天然自身抗原以及某些癌基因等。

2.1 胚胎類抗原（carcinoembryonic antigen, CEA） CEA被認(rèn)為是胃腸道惡性腫癌的特殊抗原，因呼吸道上皮來(lái)源于胚胎內(nèi)胚層，肺癌細(xì)胞也能直接產(chǎn)生。Golias等[12]應(yīng)用免疫放射測(cè)定（IRMA）技術(shù)對(duì)50例肺癌、20例肺部良性病變及20例健康者進(jìn)行CEA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者BALF、血清中CEA水平明顯高于其它兩組（P＜0.05），肺部良性病變組吸煙與不吸煙個(gè)體間比較，抽煙者BALF中CEA增高且具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而血清中無(wú)差異，并推論BALF中CEA水平受吸煙等其它因素影響，單獨(dú)檢測(cè)BALF中CEA來(lái)診斷肺癌具有一定局限性，應(yīng)關(guān)注吸煙者癌變可能。

2.2 糖類抗原（carbohydrate antigen, CA） CA是由一組糖基轉(zhuǎn)移酶綜合作用而產(chǎn)生的糖鏈抗原。CA125被認(rèn)為是診斷卵巢癌敏感性和特異性較高的標(biāo)志物，CA199主要作為直結(jié)腸和胰腺癌腫瘤標(biāo)志物，CA153主要用于乳腺癌的監(jiān)測(cè)和篩選及評(píng)價(jià)患者預(yù)后情況的指標(biāo)。近年來(lái)，上述抗原的測(cè)定被更多地應(yīng)用在肺癌診斷、治療和預(yù)后觀察上，取得了較好效果。

Dabrowska等[13]應(yīng)用電化發(fā)光技術(shù)分別對(duì)NSCLC患者、矽肺患者及健康志愿者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示NSCLC患者BALF中CA125水平明顯高于其它兩組，其敏感性、特異性分別為92%、80%。Solak等[14]以前瞻性研究方法選擇51例肺癌、44例肺部良性疾病進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肺癌患者BALF中CA153、CA199水平均明顯高于良性對(duì)照組（P＜0.05），檢測(cè)BALF中CA199的敏感性、特異性分別為29%、69%，CA153的敏感性、特異性分別為81.8%、68%。

2.3 多肽類抗原（tissue polypeptide antigen, TPA） 組織多肽抗原是從人體多種腫瘤組織中分離出的一種不含糖和脂的單鏈多肽抗原，在正常細(xì)胞中含量很少，但在上皮來(lái)源的增殖期腫瘤細(xì)胞中有很高的表達(dá)，對(duì)肺癌尤其是NSCLC的診斷、療效觀察及預(yù)后的判斷具有很高價(jià)值。Prados等[15]研究了289例包括肺癌與非肺癌患者的BALF標(biāo)本，并對(duì)細(xì)支氣管灌洗液（bronchial lavage fluid, BLF）、肺泡灌洗液（alveolar lavage fluid, ALF）應(yīng)用IRMA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示原發(fā)性肺癌組BLF、ALF中TPA含量明顯增高，吸煙肺癌患者ALF中TPA水平明顯高于不吸煙者，但BLF中TPA水平無(wú)差別，TPA濃度與肺癌組織類型無(wú)關(guān)，推論TPA是一種很實(shí)用、有價(jià)值的肺癌標(biāo)志物。

2.4 蛋白類抗原 細(xì)胞角蛋白19的片段（cytokeratin 19 fragments, CYFRA21-1）主要存在于上皮的細(xì)胞漿內(nèi)，正常上皮細(xì)胞呈低水平表達(dá)，而源于上皮細(xì)胞的腫瘤如肺鱗癌等可過(guò)度表達(dá)此種蛋白，是NSCLC尤其是鱗癌的重要標(biāo)志物。Dabrowska等[13]研究證明NSCLC患者BALF中CYFRA21-1水平明顯高于健康對(duì)照組，但與矽肺組比較差別不大，CYFRA21-1在BALF標(biāo)本中最佳甄別閾為3 ng/mL，并指出BALF中CYFRA21-1作為單一指標(biāo)對(duì)肺癌診斷價(jià)值不大。

鐵蛋白（ferritin, FT）是一種大分子蛋白復(fù)合物，各種腫瘤患者FT明顯高于良性病變患者。Erbaycu等[16]對(duì)肺癌、肺結(jié)核及其它肺部良性疾病患者BALF中的FT水平進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)三組患者BALF中FT水平無(wú)明顯差異（P=0.584），中心型肺癌FT平均水平為73.56 ng/mL，周圍性肺癌FT平均水平為31.54 ng/mL（P=0.087），肺癌組織類型、臨床分期不影響B(tài)ALF中的FT水平，BALF及血清FT無(wú)助于肺癌診斷。隨后，Erbaycu等[17]通過(guò)研究進(jìn)一步揭示血清FT（P=0.426）、BALF中FT（P=0.073）均與肺癌細(xì)胞類型無(wú)關(guān)，BALF中FT水平與肺癌患者生存期也無(wú)關(guān)。

2.5 腫瘤相關(guān)酶 神經(jīng)元特異性烯醇酶（neurone specfic enolase, NSE）是糖酵解-烯醇化酶的同功酶，特異性定位于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞中，是神經(jīng)源性腫瘤-神經(jīng)母細(xì)胞瘤的腫瘤標(biāo)志物。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一種神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤，可過(guò)量表達(dá)NSE。Karnak等[18]對(duì)35例肺癌、15例慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）及15例健康對(duì)照者進(jìn)行前瞻性病例-對(duì)照研究，利用雙抗體RIMA進(jìn)行NSE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組間血液、BALF標(biāo)本中NSE水平無(wú)明顯差異，肺癌組患者血液、BALF中NSE水平不因肺癌組織類型（小細(xì)胞與非小細(xì)胞）、臨床分期（I-II期與III-IV期）及有無(wú)吸煙史而有所差異，血液、BALF中NSE水平具有高度相關(guān)性，進(jìn)而推斷檢測(cè)血液NSE水平足以診斷小細(xì)胞肺癌，盡管眾所周知BALF中NSE為診斷NSCLC的重要參數(shù)。

2.6 鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC） SCC抗原是鱗狀細(xì)胞癌特有抗原，其高表達(dá)多見(jiàn)于肺及食管鱗癌。Kim等[19]利用蛋白組學(xué)等技術(shù)研究了SCC表達(dá)情況，結(jié)果顯示SCCA1 、SCCA2在鱗癌患者氣管、支氣管上皮細(xì)胞中高表達(dá)，而在粘液細(xì)胞及正常氣管、支氣管上皮細(xì)胞中不表達(dá)。2.7 肺癌相關(guān)基因

2.7.1 端粒酶（telomerase） 人類端粒酶是由端粒酶RNA、催化亞單位（hTERT/Hest2）和端粒酶相關(guān)蛋白（TEP1）組成的核糖核蛋白復(fù)合體。在正常組織、腫瘤鄰近組織和良性病變中端粒酶活性不表達(dá)或低活性表達(dá)，而在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。

Dikmen等[20]對(duì)22例肺癌、7例肺部良性病變患者進(jìn)行研究，端粒酶活性檢測(cè)的結(jié)果顯示，肺癌組BALF中端粒酶活性陽(yáng)性率為72.7%，肺良性疾病組陽(yáng)性率14.3%（P=0.011）；端粒酶活性測(cè)定敏感性、特異性分別為72.7%、85.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為0.94，陰性預(yù)測(cè)值為0.50，診斷精確度為75.8%。BALF中端粒酶活性是具有很高敏感性的肺癌腫瘤標(biāo)志物。

2.7.2 基因甲基化（methylation） 近年來(lái)有關(guān)基因甲基化與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系日益受到人們的重視，成為腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。基因甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子CpG島內(nèi)CpG5'端胞嘧啶堿基上，CpG島發(fā)生異常甲基化往往會(huì)改變基因的表達(dá)模式，導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制或沉默。啟動(dòng)子異常甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件，p53、p16及FHIT（fragile histidine triad）等常發(fā)生甲基化[21]。

Kim等[22]為確定BALF中基因特異性甲基化對(duì)早期NSCLC的診斷價(jià)值，選擇85例NSCLC患者及127例非肺癌患者，利用甲基化特異性PCR進(jìn)行了BALF標(biāo)本研究，結(jié)果顯示68%NSCLC患者p16、RASSF1A（RAS association domain family protein 1）、RARβ（retinoic acid receptor β）及H-cadherin（H-鈣粘蛋白）中至少1個(gè)基因甲基化，只有FHIT基因啟動(dòng)子甲基化與年齡和吸煙關(guān)系極為密切（r=0.36, P=0.03），并推論BALF中基因特異性甲基化為早期NSCLC診斷有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，存在于支氣管上皮的與年齡有關(guān)的FHIT基因甲基化與煙草煙霧有關(guān)。

Topaloglu等[23]用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測(cè)BALF標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，非肺癌患者存在RASSF1A、CDH1（E-cadherin）及APC（adenomatous polyposis coli promoter 1 A）的低水平異常甲基化，肺癌患者68%異常甲基化，并指出多數(shù)肺癌BALF標(biāo)本中均能檢測(cè)出甲基化，需要在肺癌早期診斷中進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

de Fraipont等[24]對(duì)49例NSCLC術(shù)后患者及77例肺癌高危人群的支氣管灌洗液（bronchial lavage, BL）標(biāo)本的p16、DAPK（death-associated protein kinase）、MGMT（O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）、FHIT和APC基因甲基化進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示49%的BL呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，周圍型肺癌38%為陽(yáng)性，中心型肺癌73%為陽(yáng)性，1/3患者早期FHIT即呈陽(yáng)性，APC甲基化較晚出現(xiàn)，且與MGMT一樣在BALF中很少表達(dá)，p16甲基化率為17%，DAPK甲基化率為15%，14例肺癌患者術(shù)后恢復(fù)正常水平，3例復(fù)發(fā)中心型NSCLC患者BALF呈現(xiàn)陽(yáng)性。結(jié)論提示BL標(biāo)本基因甲基化有助于中心型肺癌診斷，但周圍型肺癌CT掃描具有優(yōu)勢(shì)。

Schmiemann等[25]進(jìn)一步進(jìn)行了原發(fā)肺癌與復(fù)發(fā)肺癌、中心型肺癌與周圍型肺癌支氣管抽吸液APC、p16INK4a（cyclin-dependent kinase inhibitor-2A）和RASSF1A基因甲基化的對(duì)比研究，利用甲基化特異性實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative methylation-specific real-time PCR,QMSP）法進(jìn)行了聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示63%中心型肺癌、44%周圍型肺癌、71%復(fù)發(fā)性肺癌基因甲基化檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，35%細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)未能診斷明確的周圍型肺癌通過(guò)甲基化陽(yáng)性而確診，非肺癌患者只有1例呈現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，提示QMSP法基因甲基化檢測(cè)有助于周圍型肺癌的診斷。

3 BAL在診斷肺癌方面的局限性

雖然BALF標(biāo)本離心上清液利用ELISA、IRMA及酶免疫等方法，沉淀物應(yīng)用細(xì)胞分析、PCR擴(kuò)增及TRAP等技術(shù)在檢測(cè)指標(biāo)上取得了初步可喜結(jié)果，但現(xiàn)行BALF尚存在一定局限性：①BALF回收量具可變性且BAL過(guò)程可以改變BALF中成份的濃度；②BALF標(biāo)本單一腫瘤標(biāo)志物等檢測(cè)指標(biāo)的敏感性、特異性較低；③除基因methylation等為肺癌全和無(wú)現(xiàn)象外，其余大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物在肺癌以外其它肺部疾病中也可表達(dá)；④BAL時(shí)所收集的BALF中腫瘤細(xì)胞含量較少，限定了通過(guò)基因組學(xué)等各種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行肺癌診斷和鑒別診斷的難度等。

4 展望

上述局限性為BALF在肺癌早期診斷方面提出了挑戰(zhàn)。隨著細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展、各種先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)手段的逐漸采用[26]及BAL技術(shù)的不斷規(guī)范與完善[27,28]，相信BALF在肺癌早期診斷方面存在的不足將不斷被解決、完善，其應(yīng)用前景較為廣闊。