組織因子在肺癌中的研究進展

徐澄澄 綜述 付向寧 審校

作者單位：430030 武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院普胸外科（通訊作者：付向寧，E-mail: fuxn2006@yahoo.com）

早在150多年前就有人提出惡性腫瘤患者容易出現高凝血狀態，若血栓形成可能導致致命性并發癥的發生。近年來惡性腫瘤和機體凝血系統的研究表明腫瘤不僅可以激活機體的凝血系統，而且后者參與腫瘤的惡性生物學行為。肺癌是目前世界范圍內發病率和死亡率最高的腫瘤之一，組織因子作為機體凝血系統的重要始動因子，兩者存在密切的關系。本文重點對肺癌中組織因子（tissue factor, TF）的表達以及在肺癌生長和轉移中作用機制等加以綜述。

1 TF的結構特征

TF的基因位于染色體1p21-1p22，總長度12.4 kb，含6個外顯子所轉錄的mRNA為2.1 kb，最終翻譯修飾的TF位于細胞表面相對分子量為47 kDa的一單鏈跨膜糖蛋白，屬于二級細胞因子受體家族。它由263個氨基酸殘基組成，分為含有可溶性的氨基末端的胞外區（絲氨酸1-谷氨酸219）、跨膜區（異亮氨酸220-亮氨酸242）和羧基末端的胞內區（組氨酸243-絲氨酸263）。胞外區有兩個半胱氨酸對分別形成的二硫鍵組成穩定的二硫環，后者的羧基端以及該區的4個氨基酸殘基在維持TF結構穩定性和促凝活性中起到了重要作用；跨膜區為疏水性的肽段，使TF錨定于細胞膜的磷脂膽堿中，而可溶性的TF分子活性較膜性TF大大降低，說明跨膜區可能有增強其分子活性作用；胞內區一個半胱氨酸245能與軟、硬脂酸結合增加TF的跨膜穩定性，3個絲氨酸殘基能被蛋白激酶（protein kinase C, PKC）激活與TF的功能密切相關[1]。

2 TF的凝血作用與類型

機體表達的TF在Ca2+的作用下，其胞外區FVII/VIIa受體能與血漿中的FVII結合，激活FVII形成TF-FVIIa復合物，后者再激活FX、FIX啟動外源性凝血途徑，產生凝血酶，使纖維素沉淀，血小板激活，最終血栓形成。根據TF是否與細胞膜結合分為膜結合性TF和可溶性TF，后者又根據是否與血液中的微粒結合分為具有促凝活性的微粒結合型TF（TF-microparticles, TF-MPs）和非微粒結合型TF，目前對后者的作用尚不了解。最近也有學者[2,3]發現單核細胞表達產生全長型TF（full length TF, flTF）和選擇剪切型TF（alternatively spliced TF, asTF），后者因缺少正常TF基因的外顯子5編碼的跨膜區故為可溶性TF，其凝血活性較前者弱，但在新生血管的形成和腫瘤侵襲中可能起到了重要作用。

3 TF在肺癌中的表達

TF在某些組織細胞中如肺、心臟和腦等含量較多，但是正常情況下血液系統的單核細胞和血管內皮細胞等不表達TF，因此TF是唯一在正常人血漿中不存在的凝血因子。而在病理情況下，如組織損傷、炎癥或腫瘤，細菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、白介素-1（interleukin-1, IL-1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）等可以促使血管內皮細胞和單核細胞或腫瘤細胞大量表達TF。它除存在于細胞表面外，在腫瘤患者血漿中也發現TF-MPs，可能是從腫瘤細胞表面脫落釋放入血，從而啟動凝血系統，導致血栓的形成。Giesen等[4]首次檢測到TF-MPs具有凝血活性，并由體內模型中證明其在血管內血栓形成過程起到了關鍵作用。Zwicker等[5]發現在90例檢測到TF-MPs的腫瘤患者靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism, VTE）發生率為34.8%，而TF-MPs陰性的患者無一例出現VTE。

肺癌細胞表達TF[6]，而且其活性和腫瘤細胞的惡性轉移傾向有關。小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）早期侵犯和轉移能力強，NCI-H69細胞系（屬于SCLC細胞系）表達的TF被證明與其強大的粘附和轉移能力有關[7]，而周紅等[8]研究發現高轉移潛能肺癌系95D雖然表達的TF量低于低轉移的LTEP-α-2肺癌細胞系，但活性遠遠高于后者。在患者的肺癌組織與血清中同樣可以檢測到TF的異常表達，并與腫瘤的類型、分期、預后相關。目前的研究認為SCLC表達的TF較非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）高[9]，腺癌較鱗癌高[10]，晚期肺癌較早期高[11-13]，出現遠處轉移或侵犯的患者高[14]，TF可作為判斷肺癌患者預后的一個指標[15]。最近Rollin和Regina等[11,12]檢測NSCLC組織的flTF表達異常升高可能與TP53和PTEN等腫瘤基因的突變有關，但asTF升高與這些突變無關，因此asTF可能是NSCLC一種獨立預測預后的標志物。Goldin-Lang[15]也發現肺腺癌組織中均有flTF和asTF的表達，但特別是asTF表達增強不僅預示了患者合并血栓的危險性增加而且提示患者的預后更差。

4 TF參與肺癌生長轉移的信號途徑

近年來對于TF和腫瘤關系的研究表明TF可以通過凝血和非凝血兩條途徑來促進腫瘤的生長和轉移。其信號轉導通路尚未完全明確，但是目前認為主要是蛋白酶活化受體（protease-activated receptors, PARs）家族介導信號的轉導，PARs屬于G蛋白偶聯受體，分為PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4四種亞型，需要TF活化不同的凝血因子來激活。

凝血途徑：TF與FVII形成活化的TF-FVIIa復合物激活腫瘤細胞表面PAR-2，之后的TF-FVIIa-FXa復合物可以激活PAR-1和PAR-2[16]，再通過p44/42 MAPK、p38 MAPK及JNK信號轉導上調血管內皮生長因子（endothelial growth factor, VEGF）表達并抑制抗血管生成蛋白如凝血栓蛋白（thrombospondin-1, TSP-1）的表達[17]；其次FVIIa可使細胞內Ca2+濃度升高激活PKC，使胞內肌動蛋白結合蛋白-280（actin-binding p rotein 280, ABP-280）與TF胞漿尾區結合，上調MAPK信號活化局部粘附激酶（focal adhesion kinases, FAK）增加腫瘤細胞的粘附性和遷移性[18]。TF啟動外源性凝血途徑產生凝血酶（thrombin），后者與PAR1、PAR3和PAR4結合通過MARK通路產生各種促腫瘤生長因子，如：VEGF、VEGFR、bFGF和MMP-2等[19]。

非凝血途徑：TF受體胞內尾區的3個絲氨酸殘基容易被胞內的PKC磷酸化，產生的信號上調各種促腫瘤生長因子表達[20]。

5 TF在肺癌進展中的作用

5.1 TF參與腫瘤性血栓形成 目前的研究[21-24]認為主要是血漿中的TF-MPs參與了腫瘤性血栓形成的過程。MPs來源于脂筏區的細胞質膜，富含TF、P-選擇蛋白糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1, PSGL-1）和磷脂酰絲氨酸，單核細胞、血管內皮細胞、血小板以及腫瘤細胞表達的TF可以釋放入血，成為TF-MPs，啟動凝血系統。TF-MPs又可以通過自身PSGL-1和活化血小板表面P選擇蛋白結合[25]，加速血栓形成的級聯反應，形成大量微血栓。

游走的腫瘤細胞通過粘附素與血栓結合，同時腫瘤細胞表面的TF也可以使纖維蛋白沉積覆蓋于腫瘤細胞自身，隨著血栓的在血管中游走，腫瘤細胞隨之轉移[16]。Langer等[26]報道肺癌合并彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation, DIC）患者檢測到血漿中TF-MPs有極強的促凝活性。肺癌合并VTE患者TF-MPs含量高于結腸癌等其它腫瘤患者，僅次于胰腺癌[22]。機體TF活性越強，不僅預示出現腫瘤合并血栓事件的危險性越高，而且可能加速腫瘤的血運轉移，使肺癌患者的生存期縮短。Tesselaar等[24]認為腺癌患者合并VTE與TF-MPs活性升高密切相關，報道1例雙下肢特發性深靜脈血栓的患者，其TF-MPs活性異常升高，1個月后最終診斷為肺腺癌，故他們提出VTE患者若同時伴TF-MPs異常預示有患腺癌可能。但這一設想還需通過進一步的臨床研究來證實。

5.2 TF參與新生血管的生成 TF在血管形成中扮演了重要的角色，胚胎期如果缺乏TF的表達會出現血管周皮細胞異常，卵黃囊血管發育缺陷，導致胚胎的早期死亡。不僅在生理情況下，病理條件下對腫瘤新生血管的形成也起到了關鍵的作用。VEGF是目前已知最強的直接作用于血管內皮促其增殖的因子并可增加血管的通透性，參與腫瘤新生血管的形成和生長轉移[27]。沒有血管的形成，腫瘤就無法生長。目前認為TF可以上調VEGF的表達同時抑制抗血管生成蛋白如凝血栓蛋白-1（thrombospondin-1, TSP-1）來促進腫瘤血管形成，其機制主要通過TF胞漿尾區的信號轉導以及形成的TF-FVIIa復合物、凝血酶作用激活細胞表面的PARs胞內信號轉導促VEGF基因表達[28]。

研究[29,30]發現肺癌細胞表面均表達TF和VEGF，在肺癌組織中TF的表達水平與腫瘤血管密度、VEGF的表達量呈正相關，三者的表達量越高，肺癌的分期越晚，預后越差，出現遠處轉移的可能性越大。VEGF包括165、189、121和206個氨基酸的四種異構體，其中VEGF189主要功能與肺癌血管的新生和轉移密切相關[31]。Regina等[13]使用RT-PCR檢測64例NSCLC組織中TF、VEGF189和VEGF165 mRNA的水平，發現肺癌主要表達VEGF189，其mRNA在肺癌中的表達量是VEGF165的10倍，在K-ras突變的癌組織中VEGF189和TF表達均明顯升高。

TF上調VEGF的同時，后者也可以正反饋促TF表達。Kim等[32]報道腫瘤組織中的內皮細胞的VEGF通過促進p38和Erk-1/2 MARPK活性來阻斷可以抑制TF表達的PI3-K-Akt信號，使TF能夠大量表達。

總之，TF誘導VEGF的表達，促進腫瘤原發和轉移部位新生血管的形成，而腫瘤生長分泌大量的VEGF又可以使TF表達增強，導致微血栓的形成，肺部血供豐富，腫瘤細胞更容易遠處轉移。兩者即以這種方式參與了腫瘤生長和凝血系統激活的惡性循環。因此TF和VEGF之間的雙向調控機制促進了肺癌的生長和轉移。

5.3 TF參與肺癌的局部浸潤和轉移 TF在各種腫瘤局部浸潤和轉移中作用已經被廣泛地研究。Yu等人發現缺乏TF表達的腫瘤細胞不能在TF低表達的小鼠中生長，卻可在正常表達TF的小鼠中生長，說明宿主的TF才是腫瘤生長轉移所必需的。實驗動物模型[33-35]也證明了TF的過度表達或沉默可以促進或抑制腫瘤的惡性生物行為。臨床研究中發現肺癌血管侵犯轉移者TF的表達明顯高于其他肺癌患者[14]，采用RNA干擾技術抑制肺癌細胞的組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2, TFPI-2），增強了腫瘤細胞的侵襲能力。

腫瘤的浸潤轉移過程機制復雜，腫瘤細胞首先通過蛋白水解酶如MMP、尿激酶等降解細胞外基質（extracellular matrix, ECM）和基底膜，脫離周邊細胞和ECM后借助粘附因子運動，局部浸潤或侵入血管和淋巴管擴散到其它部位，最后在新的轉移病灶血管形成，腫瘤得以生長。因此這一過程中降解ECM的蛋白水解酶和粘附因子等起到了關鍵的起始作用。TF通過胞內區和TF-FVIIa復合物激活胞內信號：MMP和尿激酶型纖溶酶原活化受體表達上調，促進ECM溶解酶生成；活化FAK增加腫瘤細胞的粘附性和遷移性。凝血途徑下游產生的凝血酶、纖維素和激活的血小板同樣促進基質溶解酶MMPs和粘附分子如整合素、P-選擇素的產生，參與這一過程。轉染正義TF cDNA的腫瘤細胞MMP-2和MMP-9的表達和細胞的侵襲轉移能力增加，而轉染反義的TF cDNA抑制TF表達則相反降低[36]。最新的研究[37]在小鼠模型中發現阻斷整合素β1或β3可以抑制依賴asTF的主動脈萌芽，asTF結合整合素αVβ3促血管內皮的遷移，因此TF和整合素之間相互作用可能是腫瘤生長轉移的機制之一。

6 針對TF的腫瘤靶向治療

肺癌目前已是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，除了傳統的治療方法，靶向治療是現在的研究和應用的熱點。通過近二十年來的研究，對于TF在腫瘤發生發展中重要的作用機制認識越來越清楚，因為腫瘤血管內皮細胞和腫瘤細胞異常表達TF而正常的血管內皮細胞不表達，因此針對TF的腫瘤靶向治療特異性高，對正常組織損傷小，為腫瘤治療提供了一條新思路。

早期的研究者局限在利用TF的凝血作用來治療腫瘤。在鼠的實驗模型中通過激活腫瘤血管內皮細胞特異性表達TF，使腫瘤血管內形成血栓阻斷血流，腫瘤失去供養而壞死，取得了一定的效果[38,39]，但可能導致機體的凝血異常出現DIC或血栓可能游走而使腫瘤轉移或正常臟器栓塞限制了其臨床應用。后來主要利用TF的橋梁作用，Hu等[40]應用突變的FVII（不能啟動凝血系統） 和Fc結構域組成的免疫交聯物，高效的與腫瘤或血管表面的TF特異性結合，通過Fc結構域激活細胞溶解免疫反應，從而殺傷腫瘤。最近Kirkun等[41]合成的免疫交聯物Icon也是應用相同的原理，但毒性更小。Shoji等[42]把合成的EF24（姜黃素）以FVIIa為載體，在體內與腫瘤的TF結合后被胞吞，釋放其細胞毒性作用抑制腫瘤，增強了EF24特異的治療作用，減少了副作用。隨著TF在腫瘤生長中的作用被揭示以及最新siRNA的應用，Amarzguioui等[43]利用RNA干擾技術沉默B16黑色素瘤細胞TF的表達可以減少腫瘤在C57BL/6鼠肺部的轉移。Fang等[44]構建TFsiRNA-pSUPER表達載體，下調人神經母細胞瘤SK-N-MC中TF的表達，從而增強了阿霉素介導的腫瘤細胞凋亡作用。雖然TF靶向治療的研究在體外或動物實驗中取得了進展，但能否應用于臨床、藥物的安全性和療效還需長期的研究。