腫瘤自身抗體在肺癌早期診斷中的作用

姚毅冰 綜述 吳志浩 周清華 審校

作者單位：300052 天津，天津醫科大學總醫院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與微環境重點實驗室（通訊作者：周清華，E-mail:zhouqh1016@yahoo.com.cn）

肺癌是當今世界上對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，其死亡率居各類惡性腫瘤所致死亡的首位。世界衛生組織（World Health Organization, WHO）預測，到2025年中國每年將有超過一百萬新發肺癌患者[1]。最新統計數據[2,3]顯示，肺癌的總5年生存率僅10%-16%，而I期患者的5年生存率可達65%-75%。雖然目前臨床上已經聯合影像學技術、痰細胞學檢測、纖維支氣管鏡等多種檢測手段，但對無癥狀早期肺癌的診斷效果甚微，多數患者在就診時已發展至晚期。因此，尋找有效的早期診斷技術和方法對于延長患者生命至關重要。

近年來，許多研究[4-9]表明腫瘤在發生早期即可激發宿主體內產生體液免疫，在多種腫瘤包括肺癌患者的血清中，均可檢測到針對腫瘤相關抗原（tumour-associated antigens, TAAs）的自身抗體的存在。因此，對腫瘤早期抗原和抗體的免疫檢測逐漸成為腫瘤早診研究領域的一個熱點問題。本文綜合了腫瘤體液免疫反應的發現和作用機理，并對腫瘤自身抗體作為標志物在肺癌早診中的作用以及其鑒定方法進行了闡述。

1 腫瘤抗原與肺癌體液免疫的關系

在腫瘤免疫學的研究歷史中，有兩個主要問題曾一度是人們爭論的焦點：是否存在腫瘤抗原？如果存在，這些抗原是否能并如何被機體免疫系統識別？20世紀初，Paul Ehrlich根據在動物個體間進行腫瘤移植時，移植瘤能自行萎縮消退的現象，第一次提出了腫瘤抗原及腫瘤免疫的概念。1966年，Baldwin[10]首次證實了機體免疫系統對自發腫瘤的鑒別和排斥反應，從而奠定了腫瘤抗原研究的理論基礎。20世紀70年代初免疫監視概念正式被提出，認為在腫瘤發生早期，機體的免疫系統可以及時識別癌細胞，并進行清除或加以抑制，該理論為癌癥的早期檢測提供了新的思路。免疫監視理論成立的前提是有腫瘤抗原的存在，而機體正是依靠腫瘤抗原來識別腫瘤細胞[11]。

腫瘤抗原是指細胞癌變過程中出現的新抗原及過度表達的抗原物質的總稱。這些由于基因過表達，突變的蛋白產物或變體、異常降解蛋白可以作為腫瘤抗原誘導機體產生免疫應答。p53是目前研究最廣泛的腫瘤抗原之一。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現p53基因的突變[12]，研究[13,14]顯示肺癌患者可發生多種p53基因的突變，包括錯義突變、終止密碼子突變和移碼突變，但只有錯義突變產生過度表達蛋白，p53突變蛋白水平的增加不但具有免疫原性、引發免疫反應，而且這些過度表達蛋白發生了功能改變，增強了與抗體產物結合的穩定性。而經過轉錄后修飾的腫瘤抗原也可以誘導免疫反應，如糖基化、磷酸化、氧化和蛋白水解酶切等轉錄后修飾過程是通過產生新表位和增強自身表位呈遞和對主要組織相容性復合物或T細胞受體的親和性來激發免疫應答的，進而產生針對腫瘤抗原免疫原性表位的自身抗體[15]。Hoagland等[16]通過比較非小細胞肺癌患者和正常對照血清中結合珠蛋白的不同形式的糖基化水平，發現二者具有明顯統計學差異，而且糖基化蛋白的濃度與腫瘤分期還具有一定相關性。目前，修飾抗原引發體液免疫的機制還不完全清楚，特別是發現許多TAAs屬于細胞內蛋白[17]。其中一種假說認為腫瘤細胞的異常死亡導致修飾的胞內蛋白從腫瘤細胞中釋放出來，暴露于機體的免疫系統中，這種反復的異常腫瘤細胞死亡可導致修飾的胞內蛋白持續暴露，同時腫瘤細胞死亡過程中所釋放的蛋白酶可使蛋白隱藏的自身表位暴露進一步引發免疫反應[18,19]。

此外，一些常用的腫瘤抗原如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、細胞角蛋白19片段抗原（cytokeratin fragment antigen 21-1, CYFRA21-1）、粘蛋白1抗原（mucin 1 antigens, M1A）、組織多肽特異性抗原（tissue polypeptide specific antigen, TPS）等已被廣泛應用于肺癌臨床檢測中，但診斷的敏感度均不夠理想。

總的來說，機體產生免疫原性腫瘤抗原的機制可歸結為以下6種：基因突變；細胞癌變過程中原本不表達的基因被激活；蛋白合成過程的某些環節發生異常（如糖基化異常、磷酸化異常、蛋白水解酶切等導致蛋白質特殊產物的產生）；胚胎時期抗原或分化抗原的異常、異位表達；某些基因產物尤其是信號轉導分子的過度表達；外源性基因（如病毒基因）的表達。這些腫瘤抗原可作為評價早期診斷和患者預后的分子標記，鑒定這些免疫標記物，并探討其功能和對腫瘤形成機制的影響可能有助于揭示腫瘤形成過程中的早期分子事件[20]。

2 腫瘤自身抗體在肺癌早期檢測中的作用

大量研究[8,21,22]表明，血清中的腫瘤抗原等標志物能誘導機體產生自身抗體，在腫瘤發生還未能被臨床檢查手段檢測到的早期，機體免疫系統就可監測到低水平表達的腫瘤抗原的存在，并引發免疫反應，產生大量的抗體，起到有效的生物信號放大作用，雖然這些天然抗體的確切來源至今還未有定論，但有一種解釋是其來源于自體反應或非成熟B淋巴細胞，例如在乳腺髓樣癌中，肌動蛋白暴露于腫瘤細胞表面引發B淋巴細胞浸潤，導致大范圍的抗體反應而使腫瘤細胞壞死增加[23]。所以理論上利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多[24]，是一種非常有前景的腫瘤檢測標志物。

血清抗體比其它血清蛋白在肺癌的診斷中占優勢還體現在以下幾個方面。第一，可以對腫瘤進行早期診斷，便于早期治療，提高治愈率。多項研究[25,26]表明在影像學檢查確診實體癌數月至數年前即可檢測到自身抗體的存在，甚至有報道[27]顯示在肺癌確診前5年就可檢測到血清中有針對腫瘤抗原的抗體。Qiu等[28]用肺癌細胞系A549的分離蛋白制成芯片，對肺癌確診前1年內的血清樣本和正常對照血清樣本進行檢測，發現annexin I、14-3-3 theta和LAMR1的自身抗體在無癥狀期就已經存在，提示自身抗體檢測可作為肺癌高危人群篩查早診的一種方法。第二，自身抗體比相應腫瘤抗原滴度高，針對單一抗原的自身抗體通過免疫反應大量擴增，在血清中大量白蛋白存在干擾的情況下，較其它標志物更易檢測到[29]。第三，標本易獲得，檢測結果相對穩定。腫瘤抗原一旦被分泌入血，可能很快地被降解或清除，而自身抗體不像其它多肽一樣易受蛋白酶水解作用，可在相當長一段時間內在血清中穩定、持續存在，并且自身抗體的半衰期很長，大約是7天，每小時的波動很小，理化性質穩定，在-80oC長期保存對其活性幾乎無影響[30]。第四，其操作所用的試劑和技術簡便易行，重復性好，通過常規的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）或酶聯免疫分析（EIA）就可以檢測。

3 腫瘤自身抗體聯合檢測在肺癌早期診斷中的應用

腫瘤發生是一個多基因、多步驟的癌變過程，僅靠一個指標進行診斷，常常會導致假陽性和假陰性，所以，單個腫瘤自身抗體檢測必然存在一些局限性，影響肺癌的臨床診斷。例如，許多在腫瘤產生和發展過程中起重要作用的熱休克蛋白（HSPs）經常在腫瘤中呈過表達狀態，HSP70等的抗體在多種腫瘤中均可被檢測到[31]。一般情況下，同種腫瘤可異常地產生一種或多種腫瘤自身抗體，而不同腫瘤或同種腫瘤的不同組織類型既可檢出共同的腫瘤抗體，也可檢出不同的腫瘤抗體。糖類抗原12-5（CA12-5）雖然是公認的卵巢癌相關抗原，但由于肺組織具有與CA-125相同的抗原特性，所以其抗體在肺癌血清中的陽性檢出率也相當高[32]。這是由腫瘤細胞生物學特性的復雜性及多態性、不同腫瘤病理類型的差異、同種病理類型腫瘤細胞的異質性和腫瘤細胞基因型及細胞表型的差異等多種因素所決定的。

近年來的研究傾向于針對聯合抗體譜進行癌癥檢測。Chapman等[33]運用ELISA對肺癌（包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌）患者與正常對照人群血清中針對7種腫瘤抗原（p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5）的血清抗體進行檢測，結果顯示單一抗體檢出陽性率在5%-36%之間，診斷的特異性達到96%-100%，而7種抗體聯合檢測的敏感性可達76%，特異性為92%。Zhong等[34]將肺癌噬菌體文庫中所篩選出的免疫原性噬菌體表達蛋白構建成一個蛋白表達芯片，在大量患者和正常對照組血清中進行鑒定、分析后，選出5個表達蛋白標志物組成聯合診斷模型，其對非小細胞肺癌聯合檢測的敏感性達到90%，特異性為95%。這些研究充分說明在進行腫瘤標志物單項檢測時，特異性較高，但敏感性和準確性較低；聯合檢測后，雖然特異性有所降低，但敏感性和準確性均有很大的提高，如果在實際應用中進行優化組合，可顯著提高肺癌早期診斷率，具有很好的臨床應用價值。

4 腫瘤自身抗體的鑒定方法

成功的腫瘤血清抗體標志物鑒定方法依賴于高通量的篩選策略，隨著蛋白質組學的發展，相比于最初的單相的十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）蛋白分離技術或ELISA而言，目前改進的蛋白組學方法（如蛋白質芯片等）所篩選的腫瘤血清抗體標志物具有更高的診斷和臨床應用價值，操作也更加簡便高效[30,35]。下面介紹幾種基于抗原抗體免疫基礎上的高通量蛋白組學鑒定方法。

4.1 重組cDNA表達文庫血清學分析 1995年，Sahin小組[36]首次建立重組cDNA表達文庫血清學分析（serological analysis of recombinant cDNA expression library, SEREX）技術。它將分子克隆技術和利用患者血清對腫瘤細胞的自體分型技術結合在一起，不僅可檢測抗體反應，還可通過患者自體血清中抗原抗體反應，直接從分子水平確定抗原特性。

SEREX的基本工作流程是：提取腫瘤細胞或組織的mRNA，構建cDNA表達文庫，用含高滴度抗體的患者血清篩選cDNA表達文庫，經過2輪-3輪復篩后陽性單克隆得以富集純化。對所獲得的陽性克隆進行序列測定，然后對其進行生物信息學分析，再進一步從分子和蛋白水平這些基因的結構和功能進行研究，同時用已知抗原檢測體內相應抗體的濃度，定量分析腫瘤特異性抗體及其臨床意義。

隨著研究的不斷深入，迄今為止，已有超過2 300種腫瘤抗原基因通過SEREX技術被識別鑒定，并進入腫瘤免疫組數據庫（http://ludwig-sun5.unil.ch/CancerImmunomeDB/），其中70%為已知基因，這些能夠被機體免疫系統識別的基因產物主要包括轉錄和翻譯調控因子、代謝酶和細胞表面受體等，為腫瘤早期檢測和免疫治療提供了廣泛的分子靶點。Yue等[37]使用非小細胞肺癌血清對噬菌體展示文庫進行篩選，發現15個肺癌相關抗原和3個肺癌相關抗原的候選基因。這種方法較之于其它篩選方法，具有分析全面（全長cDNA，涵蓋了由腫瘤基因編碼的大多數蛋白、還可以鑒定出T細胞依賴性抗原[38]）、高效（一次篩選過程中鑒定出多個抗原）、方便（不需要特異CTL和瘤細胞的體外建株）等優點。但同時也存在一些局限性，比如不適用于鑒定具有翻譯后修飾功能的腫瘤相關抗原[39]；過高表達基因編碼抗原（如癌-睪丸抗原）導致此方法篩選出現固有偏倚，而使低表達的抗原無法篩選出來[40]；龐大的工作量不適用于對多例患者血清進行分析。

4.2 噬菌體展示技術 噬菌體展示技術是表達蛋白的表現型和編碼基因的基因型之間的完美結合。其原理是以噬菌體為載體，將編碼外源蛋白或多肽的基因片段定向插入到噬菌體的外殼蛋白基因區，使外源蛋白或多肽通過與噬菌體外殼蛋白融合而表達并展示于噬菌體表面，被展示的蛋白或多肽可保持相對獨立的空間結構和生物活性，進而通過親和富集等方法篩選表達特異蛋白或多肽的噬菌體[41]。

目前常用的噬菌體展示系統主要有絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統和T7噬菌體展示系統。由于噬菌體的這種特性使此技術生物淘洗過程更加省時、省力，目前多采用G蛋白珠（protein-G beads）來進行生物淘洗，通過親和-離心-洗脫-擴增的循環步驟，篩選富集到與患者血清抗體特異結合的噬菌體克隆，這些陽性克隆可以點在玻璃或硝酸纖維素膜上組成微陣列，供大量樣本高通量檢測[42]。但這種方法雖然比SEREX更加高通量，但兩者在篩選蛋白性質方面有相同的局限性。

4.3 血清蛋白質分析技術 血清蛋白質分析技術（serological proteome analysis, SERPA）技術是雙向凝膠電泳（2-DE）、蛋白印跡（Western blot）和質譜技術相結合產生的一種高通量的新技術[43]，此技術不必構建表達文庫，可分析大量患者的血清樣品，同時可統計腫瘤抗體的發生頻率，更重要的是可以發現經過各種翻譯后修飾的蛋白抗原。故此技術一經發明，立即被廣泛應用于肺癌、乳腺癌等多種腫瘤抗原的篩選及鑒定[44,45]。

SERPA的基本原理是利用雙向電泳分離腫瘤組織或細胞的總蛋白后將其轉膜，再與腫瘤患者的血清免疫雜交而顯色，通過質譜鑒定雙向凝膠上對應的反應點而確定腫瘤抗原。另一種與此技術相似的方法是多重親和蛋白譜分析（multiple affnity protein profiling, MAPP），但其自動化程度更高。這兩種方法的缺陷主要與2-DE的技術局限性有關，很難檢測到低豐度蛋白、低分子量、疏水性及不可溶性跨膜蛋白等。

4.4 蛋白質微陣列 蛋白質微陣列（protein microarray）又稱為蛋白質芯片（protein chip），是通過微加工技術和微電子技術在固體表面構建的微型生物化學分析系統，可作為一種高通量腫瘤自身抗體分析的有力工具。

生物蛋白芯片技術是將位置及序列為已知的大量蛋白（純化或重組的蛋白、腫瘤組織和細胞裂解蛋白等）、多肽分子、酶、抗原、抗體以預先設計的方式固定在載體上組成密集的分子排列，這個載體可以是二維的（如玻片、硝酸纖維素膜和微孔板等）或三維的（如微珠和納米顆粒），當標記的靶分子與芯片上的探針分子結合后，通過激光共聚焦掃描或光耦合元件（charge coupled device, CCD）對標記信號的強度進行檢測[46,47]。

蛋白質芯片技術與傳統檢測方法相比，芯片技術可以達到一次試驗同時檢測多種疾病或分析多種生物樣品的目的；使用樣品用量小；靈敏度和可靠性極高；自動化程度高等優點[48]。Madoz-Gúrpide等[49]采用腫瘤細胞系的天然蛋白微陣列分析肺癌細胞系A549分離蛋白與肺癌患者及正常對照人群血清的免疫反應，鑒定出8種蛋白可與肺癌患者血清發生反應，而與正常人血清不發生反應（P＜0.01）。此外，還發現肺癌患者血清中抗PGP9.5自身抗體明顯升高，提示其有可能用于肺癌的診斷。現在已有商業化蛋白質芯片問世并應用于腫瘤診斷研究，由美國Invitrogen公司生產的蛋白質芯片可一次性檢測8 000種重組蛋白[50]。目前，蛋白質芯片技術在早期診斷腫瘤標志物的發現和篩查、監測腫瘤進程和個體化治療反應等方面已取得長足進展。但在成本、數據分析等方面的不足還在改進中，有待真正實現低成本、標準化、規模化。

5 結論與展望

腫瘤的早期診斷是提高治愈率的關鍵，而取材簡單、無創傷、價格低的血清學檢測方法逐漸受到臨床應用研究學者的廣泛重視。體液免疫為肺癌的早發現、早診斷提供了理論依據，由于機體免疫系統對低表達的腫瘤抗原信號可進行放大作用，使自身抗體的檢測比抗原檢測更加有效，而多抗體聯合檢測更能提高檢測的敏感性，結合高通量蛋白組學研究方法，為腫瘤標志物的發現和鑒定提供了有利手段。但迄今為止所發現的標志物與各項臨床指標（如組織類型、分期等）的關系并不密切，其臨床應用前景不容樂觀[51]。因此，未來的研究方向也許需要廣泛的多中心合作、多種檢測手段來評估候選標志物在敏感性、特異性和診斷準確性方面價值，以建立高靈敏度和準確率的腫瘤早期診斷預警的多分子判別體系。