Asia I型口蹄疫病毒中和表位與羊IgG重鏈恒定區的融合表達及免疫原性測定

王景鋒，邵軍軍，李菁，高閃電，獨軍政，叢國正，林彤，常惠蕓

中國農業科學院蘭州獸醫研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室 農業部畜禽病毒學重點開放實驗室，蘭州 730046

口蹄疫 (Foot-and-Mouth Disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性并可遠距傳播的動物疫病。FMDV宿主廣泛，口蹄疫發生后由于造成動物生產能力下降，發病地區畜產品上市和出口受限以及為撲滅和控制疫情所用的巨額開支常給地區和國家造成嚴重的經濟損失。人們在與FMD長期的斗爭過程中已經充分認識到，應用疫苗進行免疫接種是預防、控制乃至消滅 FMD的有效手段之一。常規的弱毒疫苗與滅活疫苗由于其良好的免疫原性和提供的較高保護力，從而在過去和當前FMD防控中發揮了重大作用。但是這些傳統疫苗都存在多種缺點，如安全性不足、需要嚴格地冷鏈運輸及給區別自然感染動物與免疫動物帶來很大困難等。為克服傳統疫苗的缺點，利用基因工程技術研制生物安全、優質高效、價廉的新型疫苗已經迫在眉睫，而且成為FMDV相關研究的一個熱點領域，也是以后疫苗發展的必然趨勢[1]。

本研究擬在克隆Asia I型FMDV結構蛋白VP1基因并對其序列進行測定和分析的基礎上，設計和化學合成FMDV抗原表位基因，將其與綿羊免疫球蛋白IgG重鏈恒定區編碼基因串聯后在大腸桿菌中進行融合表達，從而獲得由羊免疫球蛋白IgG重鏈恒定區作為載體蛋白攜帶FMDV抗原表位的多肽抗原，對該融合蛋白的生物學活性進行鑒定后，檢測其誘發豚鼠產生免疫應答的情況。以期為進一步研制羊的FMDV表位肽疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及主要試劑

Asia I Jiangsu/China/2005 FMDV由國家口蹄疫參考實驗室保存，BHK-21細胞、大腸桿菌JM109、BL21 (DE3) 及原核表達載體pPROEx HTb由本室保存，pGEM T-easy克隆載體購自Promega公司。限制性核酸內切酶、RT-PCR反應試劑盒 (TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0)、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、低分子量蛋白質分子量標準Marker、質粒提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒均購自寶生物工程 (大連) 有限公司，RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit(50)) 購自Qiagen公司，蛋白純化試劑盒購自 Novagen 公司。細胞培養用胎牛血清和DMEM/High Glucose培養基購自Hyclone公司，兔抗綿羊IgG抗體及DAB顯色試劑購自博士德生物工程有限公司，其他試劑均購自Sigma公司。

1.2 羊IgG重鏈恒定區基因的克隆及FMDV抗原表位編碼基因的合成

按照Qiagen公司RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit(50) 使用說明從綿羊脾臟組織提取總mRNA后，進行 RT-PCR反應。首先按照 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0使用說明在PCR管中組成反應體系和設置反應條件進行反轉錄反應，然后以反轉錄得到的 cDNA為模板，用特異性引物：shIgG(C)-upper:5′-CTGCCTCAACAACACCCCCGAAA-3′；shIgG(C)-lower:5′-ATTTACCCGGAGGCTTAGAGA TCGAC-3′進行PCR擴增目的基因。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min 進行預變性；然后94 ℃ 1 min，58℃40 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環；最后72℃延伸10 min。通過 RT-PCR擴增得到目的基因并將其重組于pGEM T-easy克隆載體，對所得重組體進行酶切和PCR鑒定，陽性質粒命名為pGEM-shIgG(C)，送上海生物工程公司進行測序鑒定。

用與上述基本相同的方法，從 AsiaⅠ Jiangsu/ China/2005 FMDV細胞適應病毒中提取病毒基因組RNA，應用引物 VP31:5′-CACAAATGTACAGGG ATGGGT-3′和NK61:5′-GACATGTCCTCCTGCATCT G-3′，在56℃退火條件下，通過RT-PCR擴增得到FMDV VP1基因并將其重組于pGEM T-easy克隆載體，對所得重組體進行酶切和PCR鑒定，陽性質粒命名為pGEM-VP1(JS)，送上海生物工程公司進行測序鑒定。對測定結果進行全面分析后，選擇病毒主要抗原表位基因所在區段設計出Asia ⅠF MDV 抗原表位編碼基因并送往大連寶生物工程有限公司進行人工合成。表位基因重組于pMD19-T simple載體，并命名為pMD-F。

1.3 重組表達質粒的構建

以質粒 pGEM-shIgG(C) 為模板，應用引物P1-EcoR I:5′-GGGAATTC GCCTCAACAACACCCC CGAAA-3′和P2-Xho I:5′-GGGCTCGAGTTTACCCG GAGGCTTAGAGATCGAC-3′通過PCR擴增羊IgG重鏈恒定區基因，PCR 產物經EcoR I和Xho I酶切后，與經同樣酶切過的pPROEx HTb載體相連接，構建成羊 IgG重鏈恒定區基因的表達重組質粒pPRO-shIgG。對構建正確的 pPRO-shIgG 應用BamH I和EcoR I進一步雙酶切，然后與從pMD-F質粒上應用同樣酶切得到的表位基因片段相連接，從而構建得到融合表達FMDV抗原表位和羊IgG重鏈恒定區的重組質粒pPRO-FshIgG (圖1)。

圖1 表達質粒pPRO-FshIgG的構建Fig. 1 Construction of expression plasmid pPRO-FshIgG.

1.4 蛋白的表達、純化及鑒定

將鑒定為陽性并且測序確定正確的 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG重組表達質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3) 感受態細胞，挑取單克隆并增菌后，將陽性菌在添加氨芐青霉素的 LB液體培養基中培養過夜，然后按1%轉接到含0.06 mg/mL氨芐青霉素的 LB培養基中，37℃培養至對數生長期(OD600= 0.6)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37℃振蕩培養，取各時間段 (2 h、3 h、4 h) 的表達產物各1 mL進行SDS-PAGE分析。

在鑒定重組菌能夠正確高效表達后，將其進行大量培養并誘導表達蛋白。對表達的蛋白應用鎳離子親和層析技術進行純化，對純化產物進行SDS-PAGE分析。由pPRO-shIgG和 pPRO-FshIgG表達的蛋白分別命名為shIgG和FshIgG。然后應用兔抗山羊 IgG抗體及 FMDV標準陽性血清進行Western blotting對shIgG和FshIgG進行鑒定。

1.5 抗原制備與動物免疫

對上述純化的蛋白進行濃度測定后，用蛋白溶解液調整蛋白液濃度為200 μg/mL。按1:1的體積比加入蛋白液和206油佐劑后用玻璃注射器反復抽吸使之完全乳化而制成免疫抗原，這樣每毫升疫苗中最終含有100 μg蛋白。

將體重在250~300 g的24只豚鼠隨機分成4組(6只/組)，第一組每只豚鼠于后肢內側肌肉注射shIgG制備抗原1 mL；第二組豚鼠注射FshIgG制備的抗原 1 mL；第三組豚鼠按推薦劑量注射商品化AsiaⅠF MDV 滅活疫苗 (購自中國農業科學院中農威特公司) 1 mL作為陽性對照；第四組豚鼠注射等量PBS作為陰性對照。第1次免疫后28 d對各組動物進行第2次免疫。所有豚鼠于無FMDV的隔離環境中飼養。

1.6 血清抗體動態監測和中和抗體效價測定

在免疫前、免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d對豚鼠進行心臟采血，分離血清用于抗體測定。將Asia Ⅰ型FMDV滅活抗原用ELISA包被液進行1/8稀釋后包被ELISA反應板后，按文獻報道的方法應用間接ELISA方法測定血清中抗FMDV抗體[2]。

在96孔細胞培養板上測定并用Karber法計算AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 對BHK-21細胞的半數組織感染量 (TCID50/100 μL)[3]。通過微量中和試驗對動物免疫前、免疫后28 d和免疫后42 d采集血清中的中和抗體效價進行檢測。將待檢血清 56℃滅活30 min后，用DMEM/High Glucose培養基在96孔細胞培養板中按50 μL進行2倍系列稀釋，每個稀釋度重復4孔，然后每孔中加入50 μL含有200 TCID50/ 100 μL的病毒液，37℃細胞培養箱中作用1 h后每孔加入50 μL濃度為1×105個/mL的BHK-21細胞懸液，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養。48 h后在鏡下作初步判斷，72 h用4%多聚甲醛固定30 min，用10%福爾馬林溶液配制的0.05%亞甲基藍染液染色30 min后用水沖洗，未病變細胞孔呈藍色，發生病變而細胞脫落者不著色。試驗時設立陽性和陰性血清對照、病毒回歸試驗對照、血清毒性對照和正常細胞對照。按照Karber法計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的最高血清稀釋度，該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。

1.7 動物保護性試驗

首先測定AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 豚鼠適應病毒的ID50。取在?70℃、含有50%甘油PBS緩沖液中保存的含病毒豚鼠腳皮0.1 g置于研缽中，加石英砂研磨，用PBS緩沖液(pH 7.4) 制成1∶10 (W/V)的懸液，置于 4℃浸毒過夜。然后 2000 r/min離心10 min取上清，用PBS(pH 7.4) 進行10倍系列稀釋，將10?3、10?4、10?5、10?6、10?7稀釋度的病毒液0.2 mL于豚鼠左后跖部皮內及皮下接種，每個稀釋度接種300~350 g豚鼠4只。每24 h觀察記錄發病情況，至72 h最終判定并計算半數感染量 (ID50)[2]。

試驗豚鼠在第 2次免疫后第 14天用上述測知ID50的AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV豚鼠適應病毒進行攻毒。各組的6只豚鼠左后跖部皮內和皮下接種200倍ID50劑量的病毒液。連續觀察72 h，判定豚鼠發病情況。

2 結果

2.1 羊IgG重鏈恒定區基因的克隆

應用 RT-PCR技術，以從綿羊脾臟中提取的總mRNA為模板擴增到了預期大小的目的DNA片段，在電泳圖譜中可見一約 1000 bp左右的特異性條帶(圖2)。將上述擴增到的DNA片段與克隆載體pGEM T-easy 重組后，對所得重組體應用EcoR I酶切消化鑒定。酶切圖譜與預期一致，從重組體上切下了特異的目的基因片段。對酶切鑒定陽性的重組體pGEM-shIgG(C) 進行序列測定，測序結果表明，克隆到的基因大小為993 bp，將其與GenBank中已提交的羊IgG重鏈恒定區基因序列 (GenBank Accession No. X69797.1) 進行比較發現，克隆到的羊IgG重鏈恒定區基因序列與該序列的相似性高達99%以上。以上基本說明所克隆羊IgG重鏈恒定區基因序列的正確性。

以AsiaⅠ Jiangsu/China/2005 FMDV 細胞適應病毒中提取的病毒基因組RNA為模板，應用引物VP31和NK61擴增得到一約800 bp的DNA片段。該DNA重組于pGEM T-easy克隆載體后，對用酶切和PCR方法鑒定為陽性質粒命名為pGEM-VP1(JS) 送上海生物工程公司進行測序鑒定。結果表明，所克隆到的基因完整涵蓋了FMDV結構蛋白VP1基因片段，將其與國家口蹄疫參考實驗室已公布的該毒株的基因序列 (GenBank Accession No. EF149009.1) 比較發現，兩者的相似性為100%。

圖2 羊IgG重鏈恒定區基因的PCR擴增Fig. 2 PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of sheep IgG heavy chain constant region gene.

圖3 FMDV VP1基因的PCR擴增Fig. 3 PCR product of FMDV VP1 gene. M: DNA marker DL2000; 1: PCR product of FMDV VP1 gene.

2.2 FMDV抗原表位基因的設計、化學合成

根據上述所克隆并測定的 AsiaⅠ Jiangsu/China/ 2005 FMDV株FMDV VP1基因序列，選擇VP1的136~160aa及198~211aa位氨基酸肽段，將其應用-G GSSGG-這一短肽連接組成 136~160aa-GGSSGG-198~211aa-GGSSGG-136~160aa-GGSSGG-198~ 211aa重復串聯形式 (圖4)。對該重復串聯肽段的編碼基因進行人工化學合成，在其基因的5′端和3′端分別依次引入BamH I和EcoR I酶切位點，并將其與 pMD19-T simple 載體重組，重組體命名為pMD-F。該表位肽編碼基因大小為288 bp，共編碼96個氨基酸。

圖4 Asia I型FMDV抗原表位的設計Fig. 4 Epitope design of type Asia I FMDV.

2.3 蛋白表達、純化和鑒定

應用 SDS-PAGE檢測轉化 pPRO-shIgG和pPRO-FshIgG的重組大腸桿菌表達蛋白的情況。電泳圖譜顯示，重組菌在1 mmol/L的IPTG誘導下分別高效表達了一個40 kDa左右和45 kDa的蛋白，大小與預期目的蛋白大小相符。表達的蛋白應用鎳離子親和層析技術進行了純化，純化蛋白的純度可達80%以上 (圖5)。最后對純化的蛋白應用Western blotting技術進行鑒定，結果發現純化所得的shIgG蛋白能夠和標準兔抗綿羊IgG抗體呈強陽性反應，而FshIgG蛋白則同時能夠與兔抗綿羊IgG抗體和豚鼠抗FMDV的標準陽性血清反應 (圖6)。

2.4 血清抗體的測定

將所表達的蛋白shIgG和FshIgG乳化制備成疫苗以后免疫豚鼠，應用間接ELISA方法測定血清抗體。結果表明，FshIgG蛋白制成的疫苗免疫的豚鼠在免疫后 7 d就可以檢測到特異性抗體，在后續的實驗過程中，該組動物的抗體水平一直呈持續增高的趨勢。二免后抗體水平有所提高。商品化的滅活疫苗免疫動物在免疫以后則迅速產生抗FMDV的特異性抗體，免疫21 d后就能達到很高的抗體水平，第二次免疫對該組豚鼠抗體水平未見顯著影響。作為陰性對照的應用shIgG蛋白和PBS免疫的豚鼠，在整個實驗過程中始終檢測不到特異性抗體 (圖7)。

2.5 血清中和抗體效價的測定

圖5 表達蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed protein. 1: induced BL21(DE3) control; 2: induced pPROEx HTb/BL21(DE3) control; 3: protein marker; 4: uninduced pPRO-shIgG/ BL21(DE3) control; 5: induced product of pPRO-shIgG/ BL21(DE3); 6: purified product of shIgG; 7: uninduced pPRO-FshIgG/BL21(DE3) control; 8: induced product of pPRO-FshIgG/BL21(DE3); 9: purified product of FshIgG.

圖6 shIgG和FshIgG的Western blotting分析Fig. 6 Western blotting analysis of shIgG and FshIgG protein. 1: shIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody; 2: shIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody; 3: FshIgG reacted with guinea pig anti-FMDV antibody；4: FshIgG reacted with rabbit anti-sheep IgG antibody.

用病毒微量中和試驗對各實驗組豚鼠在免疫前(0 d)、二免前 (28 d) 及攻毒前 (42 d) 所采集血清中 FMDV的中和抗體效價進行測定。結果顯示，FshIgG蛋白免疫豚鼠的血清中能夠檢測到較高效價的中和抗體。特別是在二免后兩周進行攻毒時，其中和抗體效價基本達到了滅活疫苗免疫組動物的抗體水平 (圖8)。

2.6 豚鼠攻毒試驗

不同稀釋度的適應豚鼠的 Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV 液0.2 mL接種豚鼠后，豚鼠的發病情況表明 (表1)，該病毒的ID50應在10?5和10?6之間，按Karber法計算其準確的ID50: lgID50=L?d(s?0.5)，其中，L=最高稀釋度的對數；d=稀釋度對數之差；s=發病率之和[3]。那么，該病毒的 ID50/0.2 mL為10?5.5。

圖7 免疫豚鼠的抗體水平檢測Fig. 7 Antibody level of guinea pigs post vaccination.

圖8 免疫豚鼠的中和抗體效價檢測Fig. 8 Neutralizing antibody titres of guinea pigs.

表1 Asia ⅠJiangsu/China/2005 FMDV ID50的測定Table 1 Identification of ID50 for Asia ⅠJiangsu/China/ 2005 FMDV

用上述測定ID50的Asia I型FMDV對所有免疫豚鼠進行攻擊，結果發現用FshIgG免疫的6只豚鼠與用商品化滅活疫苗免疫豚鼠一樣，所有豚鼠都未發病，而作為對照組的用PBS和用shIgG免疫的豚鼠則全部發病 (表2)。表明FshIgG蛋白免疫豚鼠后能夠給豚鼠提供一定的保護力，使得動物能夠抵御FMDV感染。

表2 免疫豚鼠抗病毒能力檢測Table 2 Protection of immunized guinea pigs from viral challenge

3 討論

口蹄疫表位疫苗的研究起步很早，早在 1981年，Kleid等首次在大腸桿菌中成功表達FMDV A12株VP1重組蛋白抗原，并進行了免疫原性的研究分析，結果顯示，重組蛋白抗原能夠誘導機體產生中和抗體，免疫動物能夠抵御同源病毒的攻擊，說明VP1蛋白是 FMDV重要的保護性抗原，這為口蹄疫表位疫苗的研制提供了依據[4]。1982年，Bittle等首次報道了用化學合成的 FMDV VP1結構蛋白C端141~160aa短肽，免疫動物后能夠誘導機體產生中和抗體，并能抵御同源FMDV的攻擊[5]。這一成果成為口蹄疫乃至整個動物疫病表位肽疫苗研究的開端。

過去的大量研究已經表明，O型FMDV結構蛋白VP1上141~160aa和200~213aa是病毒的兩個優勢中和表位，很多研究都在應用這兩個抗原表位進行O型FMDV表位疫苗的研究，并取得了很好的免疫效果[6-8]。因此，本實驗選擇了Asia I型FMDV結構蛋白VP1上與O型FMDV結構蛋白VP1上141~160aa位和200~213aa相對應的肽段136~160aa和 198~211aa作為抗原表位，將其進行了重復串聯后對其基因進行了人工合成。

但是，僅由抗原表位組成的FMDV表位疫苗并不能給動物提供完全保護。究其原因，人們普遍認為由于表位多肽分子量小，易被細胞內的蛋白酶降解，不能夠作為良好的免疫原刺激機體產生有效的免疫應答反應，所以為克服表位肽單獨存在時免疫原性低的現象，人們常將表位肽與某些蛋白分子偶聯來增強其免疫原性。這些蛋白分子常被稱為表位載體分子，它們對于免疫動物可以是外源性的，也可以是宿主自身的某些蛋白分子。作為表位載體蛋白的外源性蛋白主要有 BSA[9]、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)[10-11]、霍亂毒素、谷胱甘肽 S轉移酶 (GST) 和匙孔血藍蛋白[12]等。這些外源載體蛋白能夠增強表位抗原的免疫原性，延長小分子表位抗原在機體內的降解半衰期。但載體蛋白對機體來說是一種外源抗原，機體會產生針對載體分子的免疫應答反應，可能在一定程度上分散了機體針對疫苗表位的免疫應答能力，從而導致疫苗免疫效果不夠理想。國內外學者利用機體免疫系統不對自身物質發生免疫應答這一特點，將口蹄疫病毒VP1蛋白上的若干表位基因串聯后與豬免疫球蛋白IgG重鏈恒定區基因融合，并在大腸桿菌中成功表達了融合蛋白。利用該蛋白免疫豬后的動物保護性試驗顯示，多表位重組蛋白疫苗具有較強的免疫原性，其不僅能刺激機體產生高效價的中和抗體，也能有效地誘導機體發生細胞免疫應答，而且免疫豬能夠抵御50~100 ID50劑量的同源毒攻擊，獲得100%保護[13-14]。這在一定程度上顯示了動物自身 IgG重鏈恒定區蛋白作為表位載體蛋白的優越性。

該研究中將上述所設計的表位與綿羊IgG重鏈恒定區基因串聯后在大腸桿菌中得到了成功表達，得到了Asia I型FMDV抗原表位偶聯于綿羊IgG重鏈恒定區蛋白 N端所形成的融合蛋白 FshIgG。將100 μg FshIgG融合蛋白與206油佐劑混合乳化后免疫豚鼠，在免疫后2周應用間接ELISA方法檢測到了針對FMDV的特異性抗體。在二免以后2周，用200倍 ID50的病毒劑量對免疫豚鼠進行攻毒試驗，結果發現FshIgG免疫組的豚鼠全部得到了保護。這些結果充分地說明FshIgG蛋白具有良好的抗原性，該蛋白不但能夠與標準的FMDV陽性血清特異性反應，而且能夠在動物機體內誘導產生針對FMDV的特異性的抗體。雖然從 FshIgG免疫組豚鼠血清中FMDV抗體的檢測結果來看，抗體水平達不到傳統滅活疫苗所誘導的抗體水平，但是卻能夠提供與滅活疫苗相同的免疫保護。這可能與各自所誘導產生抗體的中和性和親和力有關系。所以通過病毒微量中和試驗對疫苗誘導產生的中和抗體水平進行了測定。結果表明，FshIgG蛋白疫苗2次免疫動物以后，動物血清中的中和抗體效價可達10?2.8，基本與滅活疫苗免疫組豚鼠血清中和抗體水平一致。此外，本實驗中之所以應用綿羊IgG重鏈恒定區蛋白作為抗原表位的載體，構建能夠應用于綿羊的FMDV表位疫苗的候選抗原，是因為綿羊在感染FMDV后的發病率相對較低、臨床癥狀不明顯，易被忽略，從而攜帶病毒成為長期的傳染源，其素有病原的“貯存器”之說。所以通過疫苗免疫提高羊群整體的FMDV免疫水平顯得尤為重要。雖然以綿羊IgG重鏈恒定區蛋白作為抗原表位的載體的優越性和該抗原在綿羊的免疫效果還需進一步的試驗來評價，但本實驗的完成為進一步研制綿羊的FMDV表位疫苗奠定了一定的基礎。

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