末端限制性片段長度多態性技術分析硝化細菌微生物多樣性

林煒鐵，朱雅楠

華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006

末端限制性片段長度多態性技術分析硝化細菌微生物多樣性

林煒鐵，朱雅楠

華南理工大學生物科學與工程學院，廣州 510006

利用T_RFLP (末端限制性片段長度多態性) 技術，分析硝化細菌富集反應器中的微生物群落結構，并對硝化細菌的豐度進行半定量研究。結果表明，培養48 h后，硝化細菌富集效果最佳，多樣性指數與初始培養相比下降了62.80%，富集出的硝化細菌主要為亞硝酸鹽氧化菌 (Nitrobacter)。同時對投加該硝化細菌前后的對蝦養殖水體進行微生物多樣性的動態研究，并推測了蝦塘水中可能穩定存在的幾種主要細菌種類，其中投加富集硝化細菌前后均存在的細菌種類包括短芽孢桿菌Brevibacillus brevis、微桿菌Microbacterium lactium、固氮弧菌Azoarcus indigens或者霍氏鮑特菌Bordetella holmesii。

T_RFLP，硝化細菌，反應器，群落結構，微生物多樣性

T_RFLP技術是一種以分子系統學原理為基礎的研究微生物種群多樣性的現代分子生物學技術[5]，在DNA水平上通過對特定核酸片段長度多態性的測定來分析比較硝化細菌培養器內微生物群落結構[6]，本研究利用 T_RFLP技術，對富集反應器內硝化細菌進行活性檢測，并對反應器內微生物群落的種群結構和多樣性進行解析并研究其動態變化，從而更好地把握硝化細菌的增殖情況，解決收貨菌種的時間問題，提高產業化效率。同時對投加該硝化細菌的對蝦養殖水體進行微生物多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 采樣

本實驗采用的硝化細菌在養殖蝦塘水中馴化2年后分離純化得到，亞硝酸鹽降解速率為580.7 mg/(g·d)，培養溫度為28℃~30℃。硝化細菌富集裝置為10 L氣升式反應器，通氣量為100 L/h，培養基組成如下：NaNO20.5 g/L，KH2PO40.136 g/L，MgSO40.14 g/L，NaCl 0.3 g/L，NaHCO31.6 g/L，FeSO40.03 g/L，采用分批式補料方式，即每天補加NaNO2，每周更換1次培養基，在此條件下檢測出硝化細菌樣品生長的遲滯期、對數期、穩定期3個具有生長代表性的時期，分別為培養12 h、24 h、48 h。蝦塘選擇深度為1米，面積3畝的對蝦養殖塘，在此塘中投加5 L OD600為40的硝化細菌。取3個生長代表期的硝化細菌富集培養液及投加硝化細菌前和投加硝化細菌后的對蝦養殖水體水樣各1 L，置于4℃冰箱中保存待用。投加硝化細菌后的水塘取樣時間參照硝化細菌富集豐度最佳時間。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌總DNA提取

DNA的提取采用液氮研磨法：將水樣取出，抽濾后將細菌粉末連續加入液氮中，快速研磨。用DNA提取試劑盒提取研磨后菌體中的總 DNA，并于?20℃保存。

1.2.2 16S rDNA的PCR擴增

引物設計：參考Fe′ray 等于1999年發表的硝化細菌 16S rDNA通用序列[7](FGPS1269，5′-TTT TTTGAGATTTGCTAG-3′；FGPS872，5′-CTAAAACT CAAAGGAATTGA-3′)。參考Leser等于2000年發表的細菌16S rDNA通用序列[8](8-27F，5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′；SD-BACT-0926，5′-CCGTC AATTCCTTTRAGTTT-3′)。引物的5′末端用6-FAM熒光標記。引物由大連寶生物公司合成。

PCR反應體系：利用1.2.1中的DNA提取物作為模板。PCR反應總體系為50 μL，內含5 μL 10×PCR Buffer，4 μL dNTPs，上下游引物各0.2 μL，0.2 μL模板DNA，0.25 μL Taq酶 (TaKaRa公司)。

反應條件：使用NOB引物，預變性95 ℃ 3 min ；變性94 ℃ 1 min ，退火50 ℃ 1 min ，延伸72 ℃ 2 min，35個循環；最終72℃延伸5 min。使用細菌通用引物[9]：預變性95 ℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火57℃45 s，延伸72 ℃ 2 min，30個循環；最終72℃延伸4 min。反應后，均置于?20℃保存。

1.2.3 PCR反應結果檢測

取5 μL PCR擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察拍照。

1.2.4 16S rDNA擴增產物的酶切

利用限制性內切酶Hae Ⅲ酶切PCR擴增得到的16S rDNA產物，反應總體系為20 μL，內含10倍緩沖液2 μL，PCR產物10 μL，滅菌水6.5 μL，內切酶Hae Ⅲ 1.5 μL。酶切產物的T_RFLP分析由上海基康公司完成。

1.2.5 T_RFLP圖譜分析

根據 T_RFLP圖譜，對反應器內硝化細菌的豐度進行半定量檢測，并對其純度進行分析。同時，通過登陸網站 http://mica.ibest.uidaho.edu/，選擇T_RFLP分析程序對樣品中出現的限制性片段(Terminal Rest riction Fragment，T_RF) 進行定性分析，每一個T_RF為一個操作分類單元 (Operational taxonomy unit，OTU)，通過提交T_RFLP檢測結果數據文件以及規定限制性內切酶Hae Ⅲ，確定其中可能含有的微生物屬性，分析樣品中的微生物多樣性。

1.3 多樣性指數計算方法

根據Hae Ⅲ酶切得到的T_RFLP圖譜中T_RF (末端限制性片段數目) 及其相對峰高值，分別計算了樣品中不同培養時期的硝化細菌的多樣性指數和均勻度指數。多樣性指數和均勻度指數的計算公式為：

均勻度指數：E1=H′/1nS

2 結果與討論

2.1 細菌總DNA的提取

富集硝化細菌培養液中提取的 DNA代表了富集培養液中所有微生物的總 DNA組成。提取的總DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，在大于19 000 bp處有一條明顯擴增條帶，如圖1所示。

2.2 16S rDNA PCR

以提取的總DNA為模板，利用NOB引物擴增16S rDNA，在397 bp有明顯的特異性擴增條帶，與引物序列擬擴增的DNA序列大小一致，如圖2所示。

2.3 基于T_RFLP技術的微生物多樣性分析

2.3.1 基于T_RFLP技術的硝化細菌反應器內微生物多樣性分析

圖1 富集硝化細菌培養液細菌總DNAFig. 1 DNA in the enrichment reactor. (A) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 12 hours. (B) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 24 hours. (C) Sample 1 was the DNA extracted from enrichment reactor after cultured for 48 hours.

圖2 基于NOB 16S rDNA的PCR擴增電泳圖Fig. 2 PCR amplifications based on 16S rDNA of NOB. (A) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 12 hours. (B) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 24 hours. (C) Sample 1 was the PCR amplifications after cultured for 48 hours.

圖3 NOB通用引物對不同時間細菌DNA樣品進行PCR，并用Hae Ⅲ 酶切后的T_RFLP圖譜Fig. 3 T_RFLP profiles based on bacteria16S rDNA with NOB primer at a different operating times. (A) Hae Ⅲ- digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 12 hours. (B) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 24 hours. (C) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria after cultured for 48 hours.

從硝化細菌反應器內提取的總 DNA的片段長度為19 000 bp，利用NOB擴增引物擴增出的16S rDNA片段大小為397 bp，符合預期的長度。圖3是用自動測序儀掃描16S rDNA的Hae Ⅲ酶切圖譜。圖譜上每個熒光峰至少代表 1種細菌或幾種近緣的細菌，每個峰面積占總峰面積的百分數代表某種類的微生物在該微生態群落中的相對數量。圖 3為培養12 h、24 h、48 h后，富集培養箱中硝化細菌的T_RFLP檢測結果。其中片段36 bp代表Nitrobacter，即亞硝酸鹽氧化菌硝化桿菌屬，與Wen等[10]在流化反應器中對 NOB的菌種檢測中發現存在硝化桿菌和硝化螺菌的結果稍有不同，可能是由于不同的反應器系統造成的檢測結果不同。本實驗利用NOB通用引物，對反應器中的硝化細菌進行檢測，并且根據 OTU數量，對硝化細菌樣品中的多樣性指數(Shannon Diversity，H′) 及均勻度指數 (Shannon Diversity，E′) 進行計算，結果見表1。

從不同時期硝化細菌反應器內的硝化細菌的OTU數量可以看出，隨著培養時間的增加，OTU減少，由此推斷出反應器內占絕對優勢的微生物種類減少；從硝化細菌的微生物多樣性指數 (Shannon Diversity，H′) 看出，隨著時間的增加，硝化細菌的種類趨于減少，尤其是當取培養48 h的硝化細菌進入穩定期時，多樣性指數更是下降了62.80%，由此可見，反應器內硝化細菌的培養純度逐漸增加。并且通過比較此時反應器內硝化細菌的菌體數量，發現培養48 h的硝化細菌的豐度比例達到97%，明顯高于培養12 h以及培養24 h的硝化細菌豐度比例(表2)。

2.3.2 基于T_RFLP技術的蝦塘內微生物多樣性分析

根據T_RFLP圖譜 (圖4) 中OTU數量，對投加硝化細菌前以及投加硝化細菌后的蝦塘水樣中的多樣性指數 (Shannon Diversity H′) 進行了計算，結果見表3。

表1 基于T_RFLP圖譜分析的微生物多樣性指數分析Table 1 Analysis of microbial diversity based on T_RFLP profiles

表2 基于T_RFLP圖譜的硝化細菌半定量分析Table 2 Semi quantitative analysis of NOB based on T_RFLP profiles

表3 基于T_RFLP圖譜分析的微生物多樣性指數分析Table 3 Analysis of microbial diversity based on T_RFLP profiles

從投加菌前后的多樣性指數可以看出，蝦塘投加菌硝化細菌48 h后，塘內細菌種類明顯增加，從微生物多樣性指數 (Shannon Diversity，H′) 來看，投加菌48 h后蝦塘內微生物多樣性大于投加菌前，變化幅度為 9%。通過表 4可以看出，投加硝化細菌后，水塘內該細菌數量占有絕對優勢。

圖4 利用細菌通用引物分析投加硝化細菌前后蝦塘水中細菌16S rDNA的T_RFLP圖譜Fig. 4 T_RFLP profiles based on bacteria16S rDNA with bacterial universal primers before and after adding nitrifying bacteria. (A) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria in the shrimp ponds before adding nitrifying bacteria. (B) Hae Ⅲ-digesting T_RFLP profiles for bacteria in the shrimp ponds after adding nitrifying bacteria.

表4 基于T_RFLP圖譜分析的蝦塘水中細菌半定量分析Table 4 Semi quantitative analysis of bacteria based on T_RFLP profiles in the pool

2.4 基于T_RFLP技術對蝦塘水中主要細菌種類進行快速定性分析

通過對投加硝化細菌前后都出現的 T_RF峰進行分析，其中投加硝化細菌前后都出現的片段為9、17、18、23、36 bp (圖4)，經檢測，片段36 bp代表投加的富集硝化細菌種群 (Nitrobacter)，與Terahara等[11]報道的廢水中的硝化細菌片段類似。17 bp代表的微生物種類可能性較復雜，不能確定具體的種屬，9 bp代表的微生物種類為短芽孢桿菌 Brevibacillus shida，23 bp代表微桿菌Microbacterium orla，18 bp代表的微生物可能是固氮弧菌Azoarcus indigen或者霍氏鮑特菌Bordetella holmesii。投加NOB 48 h后，硝化細菌在蝦塘水內作為優勢菌存在，從而可以確保對水中的亞硝酸鹽持續降解的作用。

3 結論

在硝化細菌生長遲緩期、對數期、穩定期取樣，分別進行T_RFLP檢測，當反應器中硝化細菌進入穩定期時，細菌多樣性最低，富集培養效果最高。添加穩定期硝化細菌至蝦塘水中，從T_RFLP檢測數據表明，投加硝化細菌前蝦塘水內的細菌多樣性小于投加后，并且硝化細菌可以作為優勢菌存在于養殖水體中，利用T_RFLP技術對硝化細菌生物反應器中培養的硝化細菌進行實時監控，從而尋找富集最佳時機進行投加，提高了硝化細菌的產業化效率。T_RFLP技術與生物信息學技術結合，能夠對環境中的微生物多樣性進行實時動態的檢測，是一種比較靈敏的微生物生態學研究方法。

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Analysis of microbial diversity of nitrifying bacteria by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism

Weitie Lin, and Yanan Zhu
School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China

We analyzed the microbial diversity and quantity of nitrifying bacteria in the enrichment reactor by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T_RFLP), a cultured-independent molecular technique. The result indicated that nitrobacteria enriched the best, and the diversity index decreased 62.80% compared with the initial data. Nitrobacteria were predominant in the reactor. Meanwhile, we studied the microbial diversity before and after adding Nitrobacteria into shrimp ponds, and analyzed several major bacterial species that existed stably in the pond. According to the analysis by T_RFLP program, species including Brevibacillus brevis, Microbacterium lactium, Azoarcus indigens and Bordetella holmesii were the dominant bacteria in the ponds.

Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, nitrobacter, reactor, microbial community structure, microbial diversity

隨著我國水產養殖規模的擴大以及養殖密度的大幅提高，養殖過程中廣泛使用的餌料、抗生素以及產生的大量水生物排泄物對水體造成了嚴重污染，引發了一系列的養殖環境及食品安全問題[1]。其中，高濃度的亞硝酸鹽是引起魚蝦患病甚至死亡的主要因素，硝化細菌 (Nitrobacter，NOB) 能夠通過氧化還原作用將亞硝酸鹽轉化成無毒的硝酸鹽[2]。因此，通過投加硝化細菌可以有效避免亞硝酸鹽的毒害。目前，由于硝化細菌代時長、生長緩慢、平板培養菌落較小易受雜菌污染，因此，對其研究主要停留在傳統的菌種分離、純化和生理生化特性的基礎上[3-4]，難以實現對硝化細菌富集生物反應器內硝化細菌活性的準確研究，不利于硝化細菌投加菌的產業化發展。

December 23, 2009; Accepted: February 26, 2010

Weitie Lin. E-mail: wtlin@21cn.com