現行版美國藥典微生物實驗室質量管理規范譯介

李秋菲，王小亮，繩金房

(1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061; 2.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061)

藥品的質量控制不僅與其生產過程密切相關，同時也與實驗室質量管理緊密相連。因此藥品微生物質量控制顯得尤為重要，而我國藥典至今未收錄“微生物實驗室質量管理”的相關規定。筆者將美國藥典(USP31/NF26)“微生物實驗室質量管理規范”章節譯出，以期為醫藥工作者提供幫助，同時也為我國新版藥典的修訂提供參考。微生物實驗室質量管理規范(good laboratory practices)的內容主要包括無菌操作技術、培養基質量控制、實驗菌株控制、設備控制、實驗記錄和數據評估以及工作人員培訓等。由于微生物檢測數據的變異性較大，因此實驗結果的可靠性及重現性依賴于所用方法及良好的實驗室質量管理規范。

1 培養基的制備、儲存及質量控制

1.1 制備

可選擇脫水干粉培養基或按培養基處方各成分配制培養基。生產商對脫水干粉培養基和配制好的培養基應附有使用說明，不同的培養基其制備方法不同(如加熱、添加添加劑、pH調節)，因此按照說明操作非常重要。配制好的培養基應標示有效期、儲存條件及促生長試驗的試驗菌株等。水是微生物培養基配制時常用的溶劑，純化水最常用，特殊情況下可用去離子水或蒸餾水。配制培養基時，脫水干粉培養基應完全溶解在水中，需要時可加熱助溶，但不能過度加熱(炭化)，以防止培養基中的熱敏成分遭到破壞;使用的設備應能控溫、攪拌及混合。培養基制備過程中，如果玻璃器具未清洗干凈，可能會帶入抑菌物質，因此要去除容器的殘留物并用純化水清洗干凈。培養基的滅菌應按照生產商提供的參數或驗證過的滅菌方法進行，還應提供培養基對特定生物指示菌株的無菌保證水平(SAL)。高壓蒸氣滅菌最常用，煮沸滅菌法可避免培養基中熱不穩定成分的破壞，特殊培養基需采用過濾除菌法。

滅菌方法和條件可通過培養基的無菌檢查和促生長試驗評估。若采用高壓蒸氣滅菌法，應驗證其滅菌周期，以確定合適的裝載模式。一般情況下，用驗證過的滅菌器進行滅菌，滅菌器生產商一般推薦用121℃及15 min。高壓滅菌器的載荷影響加熱速率，載荷越大，滅菌周期越長。滅菌鍋達到所需溫度較慢時，會導致培養基過度加熱而降解，因此必須注意滅菌周期驗證達到所需的無菌保證水平(SAL)。滅菌后的培養基不能繼續放在滅菌器內，那樣也會破壞培養基。不適宜的加熱及滅菌條件，可引起購買的培養基及自制培養基發生一系列變化，如顏色改變、澄清度降低、凝膠程度改變或pH改變。

對于每批培養基的pH，應在培養基冷卻至室溫后于無菌操作條件下測定，瓊脂培養基采用平頭pH計，液體培養基采用可浸沒的pH計。培養基的pH范圍應在規定范圍的±0.2之內，除非有驗證說明可接受更寬的pH范圍。

對于制備好的培養基，應用合適的平板和試管檢查以下項目:容器或蓋子是否破碎，填裝是否均等;固體培養基表面是否因脫水而使表面不平整或破碎;是否存在溶血、炭化或顏色改變，在冷凍過程中形成晶體;氣泡過多;微生物污染情況、指示劑的指示狀態(如果適宜的話);檢查批號及有效期并作記錄，記錄培養基的無菌檢查結果。

1.2 儲存

培養基生產商或供應商應采用適宜的運輸、溫度控制及儲存條件以確保水分消耗降到最低，制備好的培養基應有防護措施。培養基應有明確的標示批號、配制時間、有效期和相應的鑒別試驗，并按要求儲存。制備好的培養基在室內應按照驗證條件儲存。瓊脂培養基不應在0℃以下儲存，因為冷凍會破壞凝膠的結構。培養基不應暴露在強光或高溫下。如果要延長儲存期，瓊脂平板可密封包裹或放置于容器中以防止水分散發。固體培養基只限再融化1次，以免因過度加熱或可能的污染而使質量難以保證。再融化時可采用水浴或流通蒸氣加熱的方法。使用微波爐或加熱板進行加熱時，一定要注意因過度加熱而破壞培養基或因玻璃破碎而燙傷操作人員。已溶化的培養基可放置在45～50℃水浴中，但不得超過8 h。從水浴中取出培養基，在傾注之前應先擦干容器外壁的水，不能將水帶入無菌培養基中。處理使用過的培養基及過期培養基時，應按照地方當局的生物危害安全程序進行。

1.3 質量控制

實驗室可以自制培養基，但為了方便，多數實驗室使用脫水干粉培養基或直接購買平板或瓶裝的培養基。生產商力圖從生物來源上標準化培養基的原材料，但自然來源帶來的差異不可避免，因此必須考慮各批培養基之間的差異。不管是實驗室自制還是生產商配制的培養基，其質量均取決于制備過程。不適宜的制備過程會對微生物生長及試驗結果重現產生不良影響，其結論也不可靠。制備的培養基均應進行質量控制。對于實驗室自制培養基，按常規質量控制，項目包括pH、促生長試驗及有效期測定;若按相關驗證方法進行配制和滅菌過程受控，那么同一批脫水培養基的促生長試驗可只進行一次;若培養基的制備未經驗證，則都應進行促生長試驗測試。對于特殊培養基，測試菌株可在廠家說明的基礎上選擇，也可包括有代表性的環境分離菌株。

培養基的有效期指的是促生長試驗應滿足要求的期限。培養基的貨架期取決于培養基處方及其各成分的穩定性、容器的類型及密閉狀況。當一批培養基不滿足促生長試驗測試時，應啟動不符合事件調查，并提出糾正和預防措施，使問題不再出現。如果原因不清或沒有相關的糾正措施，任何不合格培養基均不得使用。

鑒別微生物時，常用染色劑如革蘭染色劑和氧化酶染色劑。對染色劑的質量控制類似于微生物生長培養基，選擇合適的標準控制菌，按照生產商說明書在鑒別試驗前進行測試。應特別注意用于環境檢測的培養基的質量控制。此培養基應進行終端滅菌和加倍包裹，若未進行終端滅菌，則須進行100%預培養檢查，這樣可防止環境監測時的外來污染而得出假陽性結果。對于表面接觸法取樣平板，若提高培養基瓊脂含量，也必須經驗證。

2 微生物菌株的保藏與復壯

標準一致的菌種保藏與復壯對測試結果至關重要。微生物菌種的活力及生物特性取決于適宜的處理及儲存方法，實驗室將菌種的保藏與復壯方法標準化，會減少污染幾率及降低微生物特性的改變。授權檢驗測試的菌種應來自國家菌種保藏中心，可以是冰凍的、冷凍干燥的、斜面或現成的形式，使用之前應進行純度、鑒別確認測試。現成的培養物應進行純度、一致性和接種量確認，經常使用的微生物菌種最好進行基因分析確認(如DNA指紋、16SrRNA基因序列或用適宜的探針進行PCR分析)。菌種的制備及復壯應按照供應商提供的說明或經過驗證的方法進行，對貯存培養物建議采用“種子批”技術儲存。

來自國家菌種保藏中心的原始菌株可在適宜的培養基上進行復蘇和增殖。原始菌株培養物(第1代菌株)在防凍培養基中制成混懸液，再轉移至冷凍瓶，在-30℃或更低的溫度下冷凍保存，直至使用。如果在-70℃或以低壓冷凍干燥技術保存，菌株可長期保存。冷凍的菌懸液在1個月或1周內可傳代作為工作菌株一旦打開使用，則不應再重新凍存，剩余部分應該棄去。應盡量減少工作菌株的傳代次數，以降低次級培養物的表型變異概率。

3 實驗室設備的維護

大部分設備(培養箱、水浴和高壓滅菌鍋)在購進時應按驗證過的標準進行安裝驗證、運行驗證和試用驗證。另外，定期的校準(通常為1年)也很必要。對于新購進的設備，應按質量管理部門(QAU)制定的操作規范進行驗證。微生物實驗室儀器(pH計和分光光度儀)使用時應定期進行校準和測試來證實其是否正常，校準和測試周期由儀器的種類和測試數據的重要性來決定。

4 實驗室的布局和操作

微生物實驗室的設計和布局應考慮質量規范和安全影響因素，最大可能地降低微生物的交叉污染，使微生物樣品在處理時被污染的可能性降至最低。一般來說，實驗室分為潔凈區域、無菌區域及普通區域。如有可能，無菌產品的試驗操作和培養，應在無菌區域環境中進行;如果不能達到完全隔離潔凈區和普通區的標準，可采取其他措施或無菌規范來降低污染的可能性，包括使用防護布、清潔與消毒等。在實驗室適當的位置標示處置微生物泄漏災害的方法，應對所有相關的技術人員進行防范安全事故的培訓。

樣品如有微生物生長，需要進一步的實驗室分析來確證被污染，可將樣品及時從潔凈區轉移至普通區，進行次級培養、染色、微生物鑒別及其他測試。如有可能，發現有菌落生長的樣品不應在潔凈區打開，因分離被污染的樣品和材料會導致假陽性結果。試驗人員不能在普通區檢測樣品，必須采取特殊措施包括穿防護衣、戴手套并認真進行手消毒。無菌樣品不能在普通區操作。理想情況下，所有的微生物樣品包括那些非無菌產品，應該在特殊區域或完全無菌的條件下采樣。預防樣品的微生物外來污染很重要，實驗設施的設計應使原材料及輔料能在可控條件下進行抽樣，包括適宜的無菌采樣設備。采樣系統不可能總處于無菌環境下，如水系統，但對在非無菌條件下的采樣，應說明可能引起的結果可靠性問題。對于環境檢測采樣，在裝載和卸載儀器時需進行嚴格無菌處理，如有可能，采樣儀應在檢測區中安裝微生物回收培養基。

實驗室內任何關鍵實驗步驟，如原料藥及制劑的無菌檢查，生物制品生產用菌種增殖和細胞培養等均應在控制區操作。隔離器應有更好的抗污染能力，使檢測結果的假陽性率降低，常用于無菌檢測試驗。隔離器需經兩方面的驗證，一是確保隔離器內檢測環境符合要求，二是預防由于使用消毒劑引起的假陰性結果。

5 檢測人員的培訓

參與藥品生產各個環節的每一位工作人員均應受過相關專業教育培訓，具有相關的工作經歷。微生物檢測監督及管理人員應有微生物專業知識并不斷更新，以提高操作技能。微生物實驗室應制訂特定的操作規程，這一規程在培訓中發揮兩方面的作用:首先，規程要求微生物實驗者為獲得精密度及重現性好的結果而必須采用的方法，可作為培訓的基礎;其次，可通過追蹤操作規程了解微生物工作者所受到的相關培訓，包括規程名稱和數量。培訓內容應根據各個實驗室工作人員的特殊性及其工作性質而定，培訓記錄應是現行有效的。

定期的工作評價在質量檢測中非常必要，評價內容包括衛生學、傾注平板、無菌操作技術、處理文件的能力及其他微生物檢測工作所必備的能力。負責監管的微生物實驗室主管應經過相應的教育或相關技能的培訓，如監管技巧、實驗室安全、制度管理、實驗結果分析、技術報告書寫、相關標準操作規程(SOP)以及其他指導實驗室關鍵工作等方面的培訓。

6 文件

對于實驗室測試及控制方法的文件應能進行充分說明，主要包括但不限于以下幾方面:微生物工作者的培訓及能力證明;設備的驗證、校準及保養;測試時，設備性能的檢測(如24 h或7 d的制圖記錄);培養基的制備、無菌檢查、促生長試驗及靈敏度測定;培養基的詳細記錄及控制測試，有特殊要求的關鍵成分的測試;數據及其計算、驗證，質量部或質量部經理審核意見，數據偏差的調查分析(若需要)。

7 實驗記錄的保存

數據及研究記錄對微生物實驗室至關重要，原則是測試必須按照SOP進行。SOP的內容是實驗測試的實際操作，實驗室的記錄應是確認數據真實性的關鍵證據。實驗室最低要求的記錄應該包括以下內容:測試物質，微生物名稱，程序編號，測試結果的文件，偏差(如果需要);管理者審核簽名，試驗參數(所用設備、所用微生物培養物及培養基批次)。應記錄設備的運轉情況，并按照SOP的規定定期進行校正并做好保養記錄，必要時應準備記錄薄或其他形式的記錄。另外，還應記錄設備的溫度(水浴溫度、培養箱溫度、滅菌器溫度)以備追蹤檢查。指導性的SOP及其修正應明確地記錄，修改的數據應劃一條線去除，同時附上簽名，原始數據不應擦掉或覆蓋。試驗結果包括最初的平板計數應予保留，以便復核及按照計算重現最終的測試結果。數據處理方法應在SOP中規定。所有的實驗室記錄應備案保存以防災難性損失，正式記錄的保存及取回應有程序文件規定。

8 測試結果

由于以下幾方面原因，微生物試驗的測試結果很難解釋說明:微生物在自然環境及環境污染物中普遍可見，尤其與人類關系密切的特殊微生物;實驗室進行樣品處理過程及實驗操作時，存在的潛在污染;環境或樣品中的微生物分布不均勻;微生物測試結果的差異很大。因此，預期結果的微小變化可能意義不是很大。基于微生物分析的這些特點，實驗室應最大程度地避免外來污染。同樣重要的是，必須以更廣闊的微生物視角來解釋結果，不僅要考慮自然界中存在的微生物，而且也要考慮對藥品組分、賦形劑或測試環境中可能存在的微生物，以及考慮微生物的生長特性(尤其是液體培養基中真菌的生長)。

當檢測的結果與標準或另外建立的定量目標不符時，需要進行調查，總的來說應重視兩方面的原因:實驗室操作或者環境條件帶來無效的結果、產品本身帶有一定程度的污染或特殊微生物的存在。對邊緣數值應作全面的評估，所有可影響檢測結果的觀察條件、檢測數據條件和因素均應予以充分考慮，包括測定結果與標準規定的偏離程度，重要的是試驗結果的偏離是否有統計學意義。實驗室環境、樣品保護措施、被測物的歷史測定結果及特性，尤其是與相關的微生物存活及增殖特性的關系應在調查中考慮。另外，與檢測者的交流可提供有關測定結果可靠性及過程適宜性方面有價值的信息。若確認實驗操作是檢測數據偏離的原因，則要針對問題制訂相應的改正措施。應按照修正并經過驗證的措施，對條件進行嚴格監控并對糾正措施的適宜性進行評價。如果測試結果偏離是確定的，必須記錄備案。實驗室也應有程序保證確認測試，如規定程序和指導原則無法保證測試結果，應取樣重測。