單增李斯特菌檢測方法研究進展

黃昭華,孫曉盈,高 申,謝 風*

(1.吉林省中醫中藥科學院,吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033)

單核細胞增生性李斯特菌L.monocytogenes(簡稱單增李斯特菌)被認為是引起動物和人類李斯特菌病的主要致病菌,是一種短小的革蘭陽性無芽胞桿菌,研究發現單增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3種類型.單增李斯特菌能使人畜致病,造成豬、雞等多種畜禽死亡。人感染后則主要表現為腦膜炎、敗血癥和單核細胞增多。嬰幼兒、懷孕婦女和免疫耐受病人的感染死亡率可高達20%-30%。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中,人們食用的肉、奶、蛋、水產品、蔬菜以及冷凍食品等均有不同程度的污染,在美國李斯特菌被列為7種主要的食源性致死病菌之一,已經被WHO食品安全工作計劃列為重點檢測的食源性病菌之一。因此快速,準確檢測出單增李斯特菌對臨床診斷和治療有重要意義。目前有以下幾種檢測方法。

1 傳統的細菌培養法

食品中李斯特氏菌的傳統檢驗方法是進行前增菌或選擇性增菌,以分離培養得到的可疑菌落做生化反應實驗、溶血實驗、協同溶血實驗(CAM P)等免疫學檢測,被確定為李斯特氏菌后進一步進行血清分型[1]。該方法中增菌和選擇性增菌是不可缺少的步驟。增菌的方法主要包括:冷增菌法和常溫培養方法。冷增菌法是在4℃培養30 d,有時甚至長達一年。常溫增菌需培養24 h至7 d。故傳統檢測方法需要7-11 d才能分離鑒定出李斯特氏菌,故傳統方法檢測周期較長。

2 免疫學方法

2.1 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是20世紀90年代發展起來的將層析法與免疫膠體金相結合的診斷技術,具有快速、操作簡便、與酶聯免疫法相似的特異性及靈敏度的優點,廣泛用于樣品的檢測[2]。采用免疫膠體金層析技術,對LM進行檢驗分析,可取得良好的效果。免疫膠體金技術與酶免(EIA)相比有著許多優越性。首先,它不需要酶聯免疫法中所要求的底物(顯色劑),因而可省去一些操作步驟,如洗滌、終止等,使操作簡單化。因此膠體金檢測只需10-20 min,而酶免(EIA)需要60 min以上;其次,膠體金法無污染,不會危害操作者以及污染環境,而這些問題在酶免法中常遇到;此外膠體金技術還具有檢測迅速、靈敏、不需要復雜儀器設備、產品永不褪色等優點[3]。膠體金免疫層析法可在食物、農產品測定中作為一個粗篩的快速檢測方法。

2.2 聚合酶免疫檢測方法(assurance poly clonal enzyme immunoassay,EIA)

這一方法是將樣品增菌液和陽性對照加到酶標板的微孔內,微孔的內壁上固定有對李斯特氏菌抗原有高度特異性的抗體。李斯特氏菌抗原在微孔內形成抗體-抗原復合物。一般操作方法是在樣品板內加入抗李斯特氏菌特異抗體,進孵育、沖洗程序,然后加入堿性磷酸酶結合劑,使酶與抗原結合,沖洗后加入底物顯色,用405-410 nm的光度計讀數,計算臨界值。當樣品測量值大于臨界值時為陽性結果,可疑陽性結果還需經傳統方法檢測。EIA方法需要進行兩次前增菌程序,每次增菌培養時間為24 h,后續的檢測過程大約需要2-4 h,因此比傳統檢測方法節省了很多時間。Feldsine等[4-5]運用EIA方法檢測食品樣品和環境中物體表面李斯特氏菌和李斯特氏菌屬。并和USDA/F SIS(U.S.Department of Ag riculture/Food Safety and Inspection Service)傳統培養檢測方法進行比較。結果表明,EIA方法與USDA/F SIS傳統培養檢測方法的檢測結果在統計學上是一致的。

2.3 自動酶聯熒光免疫檢測系統(VIDAS)分析方法

此分析系統是依據免疫學酶聯免疫反應(ELISA)原理對李斯特氏菌等致病菌進行快速檢測的方法,作為夾心反應,固相容器(SPR)用抗李斯特氏菌抗體包被,捕獲細菌抗原,抗原-抗體復合物可被標記有堿性磷酸酶的抗細菌第二抗體檢測,形成酶復合物,酶復合物在酶催化下將底物(4-甲基傘形磷酸酮)分解成具有熒光的產物(4-甲基傘形酮),該產物由儀器中的光掃描器檢測熒光強度(熒光強度與李斯特氏菌的含量成正比),并由計算機自動分析結果。由于該儀器檢測的假陰性率為零,假陽性率＜5%,因此該方法適合大批量樣品的篩選和快速檢測,陰性結果可直接報告;陽性結果可經過純培養后,進一步用國標法或全自動生化分析儀進一步確認,12-24h即可報告結果[6]。有資料顯示VIDAS檢測系統的特異性可達 96%,靈敏度為73%[7]。此方法采用計算機自動分析系統,不但簡便而且減少了人為誤差,可在3d內報告結果。

2.4 SPA-ELISA

姜迪來等[8]利用HRP-SPA(辣根過氧化物酶標記葡萄球菌A蛋白)代替酶標二抗,采用一步法ELISA檢測肉品中的單增李斯特氏菌,并建立了SPA-ELISA檢測肉制品中李斯特氏菌的檢測方法。研究發現,HRP-SPA可完全代替酶標二抗用于對李斯特氏菌的檢測。結果還顯示,SPA不能單獨與抗原或抗體良好地結合,而只與抗原抗體免疫復合物結合良好,對兔血清中的IgG具有較好的結合能力。故使得酶標SPA有代替酶標二抗而進行相關研究的優勢。這樣省去了制作抗體的麻煩。

2.5 免疫磁性分析(IMS)

IMS的基本原理是抗原抗體反應。寇運同等[9]指出用免疫磁珠捕集法快速檢測食品中單增李斯特氏菌的方法,可以將檢驗周期縮短至1d以內。此方法并被AOAC(證書號930701)和AF NOR(法國標準協會)批準采用。IMS-ELISA法是將IMS應用于免疫分析法。這一方法的優點在于在較低的菌液濃度時也可通過免疫磁珠的富集作用進行檢測,縮短前增菌時間,并進一步降低了單增李斯特氏菌的檢測限。該方法也存在缺點,當磁珠用單抗包被時無法識別所有的李斯特氏菌菌株,而用多抗包被時又不能區分致病性和非致病性李斯特氏菌,因此,免疫磁性分析缺乏種間的特異性,不能消除交叉反應,與其他雜菌可能發生非特異性結合,仍需用溶血實驗等生化實驗進行進一步的驗證[10]。

3 分子生物學檢測方法

隨著核酸探針雜交技術的應用,使對單核細胞增生性李斯特氏菌的檢測進入了分子水平。

3.1 探針檢測技術

這一技術是最早應用于李斯特氏菌檢測的分子生物學技術。早在1988年,Atin等[11]就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一個500 bp DNA片斷并測序,以此序列合成4種寡核苷酸探針,以32P標記該探針,經斑點雜交實驗證實,該探針只與李斯特氏菌反應,與其他種的李斯特氏菌和屬外的細菌均呈陰性,表現出很好的特異性。但探針雜交無法分辨死菌和活菌,盡管通過增菌可使死菌比例減少,相對地減少假陽性,但并不能完全杜絕假陽性結果。隨著探針技術的逐漸成熟,人們開始關注將多個DNA特異性探針固定到芯片上,制成基因芯片。基因芯片的特點是可同時檢測多種菌,可以減少實驗次數,并且檢測所需的引物較少[12]。

3.2 聚合酶鏈式反應(poly merase chain reaction,PCR)檢測技術

PCR的發展已經相當成熟,廣泛應用于李斯特氏菌的檢測。PCR擴增特異性引物一種是依據李斯特氏菌的特異毒力基因序列而設計,一種是依據李斯特氏菌基因組中特異序列而設計。常用的靶序列為hly A、iap、inl、Dth-18等毒力基因。利用PCR方法來檢測李斯特氏菌的優點是方法的特異性好,不足之處是靈敏度較低;將樣品培養物經化學抽提后再進行擴增,提高了樣品的檢出率[13];并且可以檢測到傳統增菌方法不能檢出的“活的非可培養”的李斯特氏菌。PCR技術還可對李斯特氏菌進行定量檢測。例如Nogva等[14]運用 5′-核酸酶PCR對單增李斯特氏菌定量;Choia等[15]運用cPCR對李斯特氏菌進行定量;Long等[16]以hly為靶基因,采用PCRELISA聯合檢測技術。

4 PCR-ELISA聯合檢測技術

1999年SCHEU等以單增李斯特菌mpl基因為基礎,建立了PCR-ELISA快速檢測方法,需時5-6 h,特異性較高,但未將該方法應用于食品樣品的檢測[17]METZGER-BODDIEN等應用沙門菌特異的PCR-ELISA試劑盒對沙門菌人工污染的食物樣品進行檢測,結果與標準的分離培養方法符合率高達98%[18]。PCR-ELISA技術并非PCR與ELISA的簡單結合,有其自身的技術要點[19]。首先捕獲探針必須和PCR擴增產物內部序列互補,捕獲探針序列的長度最好在17-40 nt之間。PCR-ELISA檢測優于PCR檢測的特點:(1)快速:獲得PCR產物后,ELISA檢測約需6 h,而瓊脂糖凝膠電泳檢測約需2 h。由于PCR-ELISA在增菌12 h與PCR在增菌20 h的檢測敏感性相當,檢測時間仍然縮短了4 h。(2)安全:ELISA檢測所用試劑對人體較安全,避免了瓊脂糖凝膠電泳的EB污染。(3)可大量應用:每塊微孔板有96個檢測孔,而PCR檢測受電泳槽、加樣槽的大小等限制,檢樣量相對較小目前,對LM快速檢測方法的研究,絕大部分尚停留在實驗室階段,很大程度局限于ELISA法和PCR法,而免疫膠體金層析法檢測LM具有快速、便捷的優點。(4)可廣泛應用于質檢、衛生、邊檢、醫院,也可用于家庭進行簡易檢測。其良好的特異性,較高的靈敏度,可靠的重現性和穩定性,為今后的食品中LM檢測提供了一個更為理想的快速檢測方法。

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