表面活性劑在脫落細胞免疫細胞化學技術中的應用

康筱玲,李 偉,冉志遠

隨著免疫組織化學技術的不斷發展,免疫脫落細胞學在臨床病理診斷中的應用也越來越廣泛。但在常規的脫落細胞學檢查中,常因免疫細胞化學染色陽性率低、非特異性著色等問題,導致免疫細胞化學染色結果不夠理想。表面活性劑聚乙二醇辛基苯基醚(T riton X-100)的應用,可以使免疫細胞化學染色的陽性率大大提高,且其非特異性著色顯著降低,有利于陽性結果的判斷,并且節約抗體,現將具體方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 病例采集 收集海軍總醫院病理科2007-2009年經細胞病理學檢查確診為惡性胸水及惡性腹水標本共27例,標本及時離心,固定制成涂片,95%乙醇中備用。

1.2 試劑 Triton X-100溶液,實驗用第一抗體測定增殖細胞核相關抗原(ki-67)、癌胚抗原(CEA)、白細胞共同抗原(LCA)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 質量分數 Triton X-100溶液用0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)配制成1%及0.3%質量分數的溶液。

1.4 抗體稀釋 ki-67為1∶100,CEA為1∶100,LCA 為1∶100。

2 實驗設計

2.1 分組 27例胸腹水標本隨機分為A、B、C組,A組滴入ki-67,B組滴入CEA,C組滴入LCA。

2.2 實驗步驟

2.2.1 預處理 涂片蒸餾水沖洗3次,A、B組浸泡于1%T riton X-100 20 min,C組浸泡于PBS 20 min,PBS沖洗3次。

2.2.2 消除內源性過氧化物酶 3%H2O2溶液浸泡涂片10 min,PBS沖洗3次。

2.2.3 修復 pH 6.0枸櫞酸鹽修復液,高壓鍋修復2.5 min,PBS沖洗3次。

2.2.4 滴加一抗 A、C組加入一抗,B組加入比例為2∶1的一抗與0.3%Triton X-100混合液。

2.2.5 孵育 37℃溫箱孵育2 h,PBS沖洗3次。

2.2.6 加入二抗 3組加入通用型二抗,37℃溫箱孵育30 min,PBS沖洗3次。

2.2.7 顯色 3,3-二氨黃聯苯胺(diaminobe nzidine,DAB)顯色。

蘇木素復染、脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察。

3 結果

3.1 判斷標準 ki-67以細胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性。CEA以細胞膜或細胞漿染成棕黃色或棕褐色為陽性。LCA以細胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽性。

3.2 結果判讀 A組與B組相比,細胞的陽性率表達基本一致,但B組較A組背景明顯清晰,且特異性著色深。C組細胞陽性率明顯低于A、B組。B組細胞之間排列較A組及C組整齊,且沒有成團簇擁的現象。

4 討論

脫落細胞的免疫細胞化學與組織切片相比,有標本新鮮、操作方便快捷、勿需石蠟高溫處理及細胞抗原性保存較好的優點,可在實際工作中應用[1]。但其缺點是細胞離心或涂片后黏著度較差、易掉片、非特異性沾染強、涂片面積大、耗費試劑多及標本制作重復性差等,不像免疫組織化學那樣常規開展[2]。脫落細胞胞膜較完整,抗體進入細胞內速度較慢,脫落細胞抗體作用時間較組織切片時間長,因此脫落細胞免疫組化要求的抗體濃度比組織切片相比要高[3]。T riton X-100是一種表面活性劑,能溶解脂質,增加細胞膜的通透性,有利于抗體較快深入細胞內部,從而縮短抗體作用時間并能增強陽性細胞染色結果。將涂片泡在T riton X-100溶液中進行預處理,并在滴加一抗時在抗體中混入低濃度的T riton X-100溶液,既能增加涂片中陽性細胞表達,減少非特異性著色、降低背景,又能節省抗體,是一種較好的脫落細胞免疫細胞化學方法。

[1]張智慧,孫耘田.免疫細胞化學在細胞病理學中的應用[J].中華病理學雜志,2005,34(10):672-673.

[2]熊正文,王伯法,史景泉,等.微波修復抗原技術在免疫細胞化學染色中的應用現狀[J].臨床與實驗病理學雜志,1998,14(2),177-179.

[3]潘琳,高福云,郭艷茹.脫落細胞免疫細胞化學技術[J].中華病理學雜志,2007,36(7):491-493.