新分子學(xué)技術(shù)在產(chǎn)前診斷非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用

SOGC

1 簡(jiǎn)要說明

目前可利用的非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法包括熒光原位雜交（FISH）及定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）。多樣性連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）是仍處于研究階段的新技術(shù)。

已知FISH和QF-PCR技術(shù)（目前已有的證據(jù)也顯示MLPA技術(shù)），在細(xì)胞遺傳學(xué)全核型分析方面擁有相似的敏感性和特異性（目前是檢測(cè)13、18、21及性染色體的“金標(biāo)準(zhǔn)”）。MLPA和QF-PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于顯著地降低了檢測(cè)時(shí)間，且自動(dòng)化檢測(cè)批量樣本使得單位樣本的檢測(cè)費(fèi)用大大降低。FISH技術(shù)難以做到自動(dòng)化，仍比PCR技術(shù)檢測(cè)費(fèi)用高。

目前非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法的主要缺陷是無法檢測(cè)目標(biāo)染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變。其中一些疾病在臨床上可預(yù)測(cè)有一定的發(fā)病率。

未來，RAD技術(shù)可能適合胎兒非整倍體畸形風(fēng)險(xiǎn)增加而需侵入性診斷明確的孕婦，但不適合有其他風(fēng)險(xiǎn)如B超提示的胎兒結(jié)構(gòu)異常或有染色體重排（如平衡易位）的個(gè)人或家族史者。此類孕婦仍需進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)全核型分析。

在產(chǎn)前診斷中引入這項(xiàng)新技術(shù)時(shí)應(yīng)該綜合分析它所帶來的風(fēng)險(xiǎn)、收益和成本。RAD技術(shù)可能在未來在羊水穿刺診斷非整數(shù)倍染色體病方面，作為全染色體核型分析的替代技術(shù)。然而，爭(zhēng)論的焦點(diǎn)在于侵入性診斷方法將增加妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，使得“完整”的檢測(cè)更能獲得接受。因此，產(chǎn)前分子生物學(xué)技術(shù)需要有更多低成本的染色體疾病的診斷。

本文僅綜述該領(lǐng)域當(dāng)前的臨床和科學(xué)研究進(jìn)展。文中所涉及內(nèi)容不應(yīng)作為授課內(nèi)容或成為指導(dǎo)臨床治療和操作的依據(jù)。各地學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)可以對(duì)本文內(nèi)容和觀點(diǎn)做修正。若根據(jù)當(dāng)?shù)厮胶颓闆r作相應(yīng)修正的，需做好備案或記錄。若未獲得SOGC組織書面許可，禁止以任何形式復(fù)制本文內(nèi)容。

2 引言

加拿大預(yù)防及健康中心推薦產(chǎn)前篩查染色體疾病，特別是對(duì)唐氏綜合征的篩查，并允許孕婦自己做出是否繼續(xù)妊娠的選擇［1］。通過羊水穿刺或絨毛膜活檢技術(shù)進(jìn)行的檢查有0.5%的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，且上述技術(shù)受到有限公共醫(yī)療資源的限制而不能推廣。因此，新的指南建議通過非侵入性方法篩選唐氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦作為侵入性檢查的對(duì)象［2］。除了診斷唐氏綜合征、13和18三體，在某些情況下仍需用到侵入性檢查。例如B超發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，或父母一方有染色體重排可能造成胎兒染色體異常時(shí)，其他類型的染色體異常（缺失或重疊）風(fēng)險(xiǎn)增加，仍需用到侵入性檢查。

G顯帶全核型分析是目前對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體病標(biāo)準(zhǔn)的侵入性檢查方法，檢出率大于1／300，這和該技術(shù)導(dǎo)致的流產(chǎn)率接近。核型分析在診斷常染色體13、18、21三倍體和性染色體一些非倍數(shù)性畸變時(shí)有100%的敏感性和特異性，這些畸形占胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的大部分且與孕婦年齡偏大有關(guān)［3］。此外，核型分析在檢測(cè)其他染色體畸形時(shí)也有作用，包括數(shù)目上（如三體和特定結(jié)構(gòu)異常染色體）和結(jié)構(gòu)上（缺失、易位、倒置或插入），其分辨能力在1 000萬個(gè)堿基對(duì)左右。這種染色體畸變常與母親年齡無明顯關(guān)系且與生化篩查結(jié)果無關(guān)，常為偶然發(fā)現(xiàn)或超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)檢出［4，5］。

核型分析也有很多應(yīng)用上的局限［6］。由于檢測(cè)需要細(xì)胞培養(yǎng)和收獲，同時(shí)需要大量實(shí)驗(yàn)分析處理，故全核型分析需要7～14天時(shí)間。各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的核型分析費(fèi)用不一，平均一次全核型分析大約需要500加元，包括材料和技術(shù)人員時(shí)間（J.Chernos，personal communication，June 2006）。為研制有力的分子基因檢測(cè)技術(shù)目前已投入大量努力，這種技術(shù)分析前無需細(xì)胞培養(yǎng)并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，因此可以提供更加快捷的檢測(cè)結(jié)果同時(shí)降低醫(yī)療費(fèi)用，節(jié)約醫(yī)療資源。這種新方法的主要缺陷是無法檢測(cè)目標(biāo)染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變，而其中一些疾病在臨床上有顯著的發(fā)病率。

3 非整倍性染色體疾病快速診斷方法

目前臨床應(yīng)用的有效的RAD檢測(cè)技術(shù)主要有2種：FISH和QF-PCR，需要指出的是它們作為核型分析的補(bǔ)充，而不是替代。MLPA是一項(xiàng)針對(duì)其他適應(yīng)證的新技術(shù)，目前仍處于研究階段，將來可能用于產(chǎn)前診斷。

3.1 熒光原位雜交（FISH）

3.1.1 技術(shù) FISH應(yīng)用一個(gè)熒光標(biāo)記的探針，以發(fā)現(xiàn)一段特定的DNA序列，這個(gè)探針可與其選擇性配對(duì)［7］。產(chǎn)前診斷時(shí)，F(xiàn)ISH用于非培養(yǎng)的，分裂間期的細(xì)胞。為了達(dá)到快速診斷的目的，探針特異性的檢測(cè)13、18、21、X和Y染色體。樣本用顯微鏡觀察，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)代表該細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)染色體的拷貝數(shù)。操作指南要求計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以排除超過10%～15%的染色體鑲嵌，該水平近似于全核型分析。

3.1.2 臨床應(yīng)用 在英國(guó)和歐洲，對(duì)分裂間期的細(xì)胞進(jìn)行FISH檢測(cè)非常廣泛，常結(jié)合全核型分析［8，9］。在加拿大大多數(shù)研究中心，F(xiàn)ISH 作為染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)和高齡妊娠附加檢查，以便為決定終止妊娠的夫婦提供更快速的診斷。FISH也可用于診斷與胎兒結(jié)構(gòu)畸形相關(guān)的幾種常見染色體微缺失（22號(hào)染色體長(zhǎng)臂11位點(diǎn)基因缺失綜合征，與某些心臟畸形有關(guān)）或者夫婦已生育一染色體微缺失的后代。

3.1.3 優(yōu)點(diǎn)和局限 在英國(guó)一項(xiàng)醫(yī)療技術(shù)評(píng)估中，F(xiàn)ISH對(duì)目標(biāo)染色體非整倍性缺失敏感性和特異性均為100%［10］。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以診斷三體性。FISH主要的局限和限制其費(fèi)用降低的因素是FISH需人工操作［10，11］。FISH 分析需要大量的時(shí)間及熟練的技術(shù)。母體細(xì)胞富集（少見）可干擾檢測(cè)診斷。此外FISH和全核型分析使得費(fèi)用加倍，可達(dá)1 000美元（J.Chernos，personal communication，June 2006）。

3.2 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

3.2.1 技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一項(xiàng)公認(rèn)的分子遺傳學(xué)技術(shù)，它通過特異性引物結(jié)合來選擇性地?cái)U(kuò)增相應(yīng)的染色體DNA片段。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）是一項(xiàng)可以測(cè)量DNA序列拷貝數(shù)的新技術(shù)［11-13］。通過QF-PCR技術(shù)，科學(xué)家可以對(duì)未培養(yǎng)的羊水細(xì)胞或絨毛中提取的DNA中感興趣的染色體上（13，18，21，X和 Y）特異的DNA多態(tài)性標(biāo)記物進(jìn)行擴(kuò)增。熒光標(biāo)記引物結(jié)合到每個(gè)靶序列，使DNA聚合酶鏈復(fù)制，合成雙鏈DNA。擴(kuò)增后，毛細(xì)管電泳分離產(chǎn)物。計(jì)算機(jī)輔助測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度可以測(cè)量每個(gè)靶序列即每個(gè)染色體的拷貝數(shù)。

3.2.2 臨床應(yīng)用 在一些歐洲國(guó)家，例如英國(guó)，QF-PCR普遍被用于檢測(cè)常染色體和性染色體的非整倍體異常［14-17］。目前，這一技術(shù)在加拿大并沒有被普遍用于產(chǎn)前診斷。

3.2.3 優(yōu)勢(shì)和局限性 根據(jù)英國(guó)健康技術(shù)評(píng)估，QF-PCR技術(shù)在檢測(cè)非整倍體異常上與原位雜交技術(shù)（FISH）以及核型分析一樣是可靠、精確的，并且其靈敏度和特異度分別達(dá)到95.65%和99.97%［10］。此外，這一技術(shù)還可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出三倍體。QF-PCR技術(shù)可以在全核型水平上檢測(cè)到嵌合體［18］。由于母源細(xì)胞污染而掩蓋胎兒染色體核型異常的問題被減少到最低，并在少數(shù)研究中這一結(jié)果是模棱兩可的，通過比較母親的血液樣本可以用來作出裁決［11］。這一技術(shù)相比FISH的主要優(yōu)點(diǎn)是易于自動(dòng)化操作和樣本的定量，從而降低成本至每樣本約20美元［10］。然而，大部分診斷實(shí)驗(yàn)室使用商業(yè)套件來操作QF-PCR的，這可能使成本超出這一數(shù)額。

3.3 多重連接探針擴(kuò)增

3.3.1 技術(shù) 多重鏈接探針擴(kuò)增（MLPA）是一項(xiàng)基于PCR的新技術(shù)，它可以分辨出DNA特異性序列之間的拷貝數(shù)的差別［19］。當(dāng)MLPA探針與鄰近靶序列完全雜交，由兩部分組成的獨(dú)特的探針就可以通過DNA聚合酶連接在一起，用1對(duì)通用引物擴(kuò)增連接好的探針，就可以使所有的靶位點(diǎn)被擴(kuò)增。通過毛細(xì)管電泳后按大小分離產(chǎn)物，每個(gè)擴(kuò)增峰代表特異性探針的擴(kuò)增產(chǎn)物。通過一系列標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可以測(cè)量靶序列甚至每條染色體的拷貝數(shù)。

3.3.2 臨床應(yīng)用 MLPA是一項(xiàng)新興的技術(shù)，并且許多獨(dú)立的研究團(tuán)隊(duì)已將該技術(shù)用于非整倍體檢測(cè)的產(chǎn)前診斷應(yīng)用［20-23］。然而，這一新技術(shù)并未被那些使用FISH或QF-PCR的研究中心作為常規(guī)的檢測(cè)方法。MLPA技術(shù)還有其他方面的應(yīng)用，包括結(jié)合FISH技術(shù)進(jìn)行微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷。目前，更多研究專注于一些MLPA試劑盒的研發(fā)，以此來進(jìn)行一些其他方法不能檢測(cè)的疾病的產(chǎn)前診斷（例如Prader-Willi和 Angelman）。

3.3.3 優(yōu)點(diǎn)和限制 MLPA技術(shù)已被證明是一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方法，并且其成本與QFPCR檢測(cè)法相差無幾［21］。目前已報(bào)道的非嵌合體性非整倍體異常檢測(cè)的靈敏度為100%，特異度為99.8%，但這僅是對(duì)527例羊水穿刺樣本進(jìn)行檢測(cè)所得的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)相對(duì)較少。MLPA有許多潛在的優(yōu)勢(shì)，包括低成本以及一個(gè)樣本可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)（最多可達(dá)到40個(gè)）。當(dāng)然這一技術(shù)也有許多不足之處而難以進(jìn)一步發(fā)展，包括無法檢測(cè)所有的三體綜合征；無法確定對(duì)嵌合體異常的檢測(cè)靈敏度；以及該檢測(cè)方法比較費(fèi)時(shí)。MLPA目前仍處于研究階段，尚無法廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。

4 討論

我們已經(jīng)分析了RAD檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)及其局限性。顯然，分子遺傳學(xué)作為一個(gè)輔助手段，在染色體疾病的產(chǎn)前診斷方面有積極的推動(dòng)作用，而不是替代細(xì)胞遺傳學(xué)。FISH和QF-PCR技術(shù)是眾所周知的，而MLPA檢測(cè)法的在胎兒非整倍體檢測(cè)方面（13、18、21及性染色體異常）的靈敏度及特異度同全核型分析無差。而QF-PCR和MLPA檢測(cè)法相比全核型分析更有優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在大大縮短了檢測(cè)運(yùn)轉(zhuǎn)周期、檢測(cè)自動(dòng)化、樣本定量后降低了每個(gè)樣本的檢測(cè)成本。而FISH檢測(cè)法不能做到自動(dòng)化檢測(cè)，并且成本高于基于PCR的其他檢測(cè)方法。

在加拿大大多數(shù)的研究中心，會(huì)對(duì)一些高風(fēng)險(xiǎn)妊娠孕婦進(jìn)行RAD檢測(cè)（主要是FISH），因?yàn)檫@可以更快地提供結(jié)果給她們以決定是否終止妊娠。RAD檢測(cè)資格是基于地區(qū)確定的標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)定的，這需要考慮到額外的成本、陽性結(jié)果的可能性、以及對(duì)臨床管理的影響。例如在一些研究中心，對(duì)懷有非整倍體胎兒風(fēng)險(xiǎn)達(dá)到1／20甚至更高的婦女或者妊娠晚期孕婦可進(jìn)行FISH檢測(cè)。在這種情況下，認(rèn)為RAD進(jìn)是一項(xiàng)輔助檢測(cè)，仍推薦采取全細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析檢測(cè)。

FISH或者QF-PCR檢測(cè)方法是否是這些情況下惟一的選擇是有爭(zhēng)議的［5，13，17，24-27］。支持者認(rèn)為使用QF-PCR進(jìn)行快速非整倍體檢測(cè)是一種高性價(jià)比的方法，這可以對(duì)篩查陽性的孕婦檢測(cè)出絕大多數(shù)有臨床意義的染色體異常。這一方法不僅快速，并可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體技術(shù)，接近100%地檢測(cè)出13、18、21三體及單倍體X等染色體異常，而無需進(jìn)行全核型分析。反對(duì)者堅(jiān)決主張任何對(duì)于染色體異常檢測(cè)的漏檢都是不可接受的。他們認(rèn)為撫養(yǎng)殘疾孩子對(duì)于其父母的無形付出比起快速非整倍體檢測(cè)為他們省去的費(fèi)用沉重得多。需要強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于所有超聲檢測(cè)出異常的病例（包括胎兒頸項(xiàng)透明測(cè)量大于3.5mm以及胎兒異常）或者有疾病遺傳史的孕婦，全核型分析作為備用培養(yǎng)檢測(cè)方式是必要的。

另一個(gè)支持RAD檢測(cè)的理由是這可以避免使用侵入性方法對(duì)罕見的染色體異常進(jìn)行不必要的檢測(cè)鑒定（13、18、21三體異常）。染色體異常預(yù)測(cè)結(jié)果通常是沒有或者不確定，這在遺傳咨詢上臨床意義的表述是有困難的，這有可能會(huì)引起孕婦夫婦的焦慮，可能會(huì)導(dǎo)致想繼續(xù)妊娠的孕婦選擇終止妊娠。然而事實(shí)上，其他染色體異常的預(yù)測(cè)（或有可能）有臨床意義，Ogileve等［24］指出對(duì)于一般人群而言，非整倍體染色體異常的檢測(cè)率在產(chǎn)前和產(chǎn)后是相似的。孕婦通常因?yàn)閼延蟹钦扼w胎兒風(fēng)險(xiǎn)較高而要承受侵入性檢測(cè)，但其實(shí)她們生育非整倍體染色體異常胎兒的風(fēng)險(xiǎn)并不比未選中的妊娠婦女高［4］。

在產(chǎn)前診斷方面，如同其他醫(yī)療領(lǐng)域，進(jìn)展的衡量標(biāo)準(zhǔn)是隨著時(shí)間的推移是否可以為患者提供更多的信息和選擇（例如，更多的篩查方法選擇和更好的診斷性檢測(cè)）。然而在某些情況下，僅做RAD檢測(cè)來替代核型分析意味著給孕婦提供更少的信息，而不是更多。分子生物學(xué)技術(shù)很可能成為解決這一問題的關(guān)鍵，從而可以向患者提供更多的信息。MLPA和微陣列分析（Rickman等［3，28］的綜述）這些最佳的技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)更多的疾病，同時(shí)，生物技術(shù)行業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)也大大降低了檢測(cè)的成本。可以想象在不遠(yuǎn)的將來，接受羊水穿刺的婦女可以通過這一項(xiàng)檢查來選擇檢測(cè)全部或者部分染色體非整倍體異常，而所需的費(fèi)用比目前的核型分析要低。

詞匯表

非整倍體：染色體數(shù)目不是23的整倍數(shù)，通常是指在配子產(chǎn)生過程中由于減數(shù)分裂時(shí)未發(fā)生分離錯(cuò)誤引起的。

常染色體：除了性染色體外的其他染色體。

染色體：包含一條DNA單鏈的線性結(jié)構(gòu)，人體通常含有46條染色體，分成23對(duì)。

DNA雜交：標(biāo)記的DNA探針與互補(bǔ)的靶序列結(jié)合。

染色體組型：一個(gè)人的染色體組成，即個(gè)體的染色體顯微照片，系統(tǒng)地排列成23對(duì)。

單體型：1條染色體缺失。

嵌合型：個(gè)體或組織中存在2個(gè)或更多不同基因型的細(xì)胞系。

染色體數(shù)量畸變：染色體數(shù)量不是46。

染色體結(jié)構(gòu)畸變：染色體數(shù)量為46，但存在部分染色體缺失（刪除）、增加（插入）或重排（易位或倒置）。

三倍體：1條染色體數(shù)量為69（每條染色體存在3份拷貝）。

三體型：存在1條額外的染色體。

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