非綜合征型耳聾相關分子生物學進展

要跟東 李守霞 趙運果 陳丁莉

（邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001）

前言

耳聾是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，病因復雜，遺傳因素在其發病中占有重要位置。大約80%遺傳性聾為非綜合征型［1］。2006年底第二次全國殘疾人抽樣調查結果顯示，我國聽力殘疾者共有2 670萬人，占殘疾人總數的19.3%。1～7歲聽力障礙兒童為80萬，每年新生聾兒超過3萬。遺傳性耳聾可分為2種：一種為綜合征型耳聾（syndromic hearing impairment，SHI）；另一種為非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI），即不伴有其他癥狀的耳聾。遺傳性耳聾按遺傳方式可分為4類：常染色體隱性遺傳（autosomal recessive deafness，DFNB）、常染色體顯性遺傳 （autosomal dominant deafness，DFNA）、X連鎖遺傳（x-linked deafness，DFN）和線粒體基因遺傳（mitochondrial deafmess，DFNM），常染色體隱性遺傳性非綜合征型聾（autosomal recessive nonsyndromic hearing loss，ARNSHL）占NSHL的80%，其特點是除了聽力下降外沒有其他疾病特征［2］。許多耳聾患者由于基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態性造成對致聾環境因素易感性增加而致病。因此，遺傳性耳聾的分子病因學研究非常重要。目前，非綜合征型耳聾已確定了135個基因座，41個非綜合征型耳聾基因被克隆。隨著分子生物學技術的發展，我國在耳聾基因方面的研究有了很大提高。本文回顧了近幾年來我國對非綜合征型耳聾的一些研究熱點。

1 核基因

1.1 GJB2 編碼連接蛋白26（Connexin26，Cx 26） Kelsell等［3］在1997年找到了第一個非綜合征型耳聾基因，即Cx26基因（GJB2）。GJB2基因相關表型主要和ARNSHL有關，多達50%的ARNSHL是由于GJB2基因突變引起的［4］。聽力下降以高頻為主累及全頻的非進行性聽力障礙為特征，且聽力損失以重度和極重度為主。GJB2基因定位于人染色體13q11-12，編碼Cx26蛋白，屬于β-2型蛋白。它是鉀離子循環通路的一部分，對于耳蝸正常滲透壓及聽敏度的維持起著極其重要作用。

GJB2基因是目前研究最為廣泛的基因，該基因的突變幾乎覆蓋整個編碼區。GJB2基因型相關表型表現形式多種多樣，呈現高度的異質性。目前已發現GJB2基因有111種突變方式，其中顯性突變9種，隱性突變 92 種，如 33、35delG，33、35insG、167del T、233、235delC，299、300del AT等，未知突變10種。在歐美的高加索人種中，25%～50%的NSHI患者發生GJB2雙等位基因突變，35delG占所有突變的58%～88%；北歐的猶太人種中167del T為主要突變，占40%；在日本和韓國，235delC為GJB2基因的主要突變［5］。在中國，兒童語前聾的26%～33%為GJB2基因突變所致，占常染色體隱性遺傳性聾的28%，其突變的主要方式為233-235delC，檢出率為13.64%～21.5%。柯肖枚等［6］在中國人群中未發現35delG，而GJB2基因的編碼區233-235delC純和性突變是導致遺傳性非綜合征型耳聾的原因之一。王蘋等［7］對219例不同的耳聾患者篩查，結果顯示中國人中GJB2基因233delC突變的發生率為21.5%。Hwa等［18］發現臺灣的324例語前NSHI患者發生GJB2基因雙等位基因突變結果為5.90%。戴樸等［9］在一次全國性重癥感音性耳聾的分子流行病調查中收集了全國13個省市非綜合征型耳聾病例1 680例，篩查出GJB2基因235delC共305例，其中235del純合突變檢出率8.81%，雜合突變檢出率9.35%、總突變檢出率18.16%，而且全國各地區間檢出率差異較大。郭玉芬等［10］檢測801例中國西北地區NSHI患者中，GJB2的純合性突變頻率為8.99%（72／801），235delC占所有突變的78.79%（156／198），其次為299-300del AT，占所有突變的15.66%（31／198），而35delG僅占1.5%，167del T沒有檢測到。

目前已發現引起GJB2編碼區的第235位點堿基C的純合性缺失，使遺傳密碼發生移碼突變，產生無功能的縫隙連接蛋白，后者降低縫隙連接的通透性，影響通道的正常開閉，使鉀離子回流進入內淋巴液的循環受到影響，導致Corti器的鉀中毒，從而引起感音神經性聾（sensorineural hearing loss，SNHL）［11］。

1.2 GJB3編碼連接蛋白31（Connexin31，Cx 31） GJB3突變可以引起常染色體顯性或者隱性遺傳非綜合征型耳聾。1998年夏家輝等［12］最早報道了2個引起顯性遺傳高頻聽力下降的GJB3突變，他們對42個遺傳性耳聾家系進行GJB3篩查，在一個浙江的耳聾家系中發現GJB3錯義突變（547G＞A），使得連接蛋白Cx31第183位氨基酸由谷氨酸變成賴氨酸（Cx31E183K）。在一個湖南耳聾家系中發現GJB3無義突變，（538C＞T），導致第180位氨基酸變為終止密碼子（Cx31R180X）。劉學忠等［13］報道2個引起隱性遺傳耳聾的GJB3基因突變，他們篩選了25個患有隱性遺傳性耳聾的中國四川家系，在其中2個家系中發現2個GJB3突變，一個是423～425del ATT，導致第141號編碼氨基酸異亮氨酸缺失；另一個是423A＞G，使得141號氨基酸由異亮氨酸變成纈氨酸。423位異亮氨酸位于連接蛋白的第3個保守跨膜區，是縫隙連接孔壁形成的關鍵部位。Uyguner等［14］在一個土耳其DFNB家系發現GJB3基因667C＞A，導致編碼氨基酸P223T改變。孫勍等［15］在31個DFNA家系中共檢測到2種GJB3基因核苷酸序列改變形式（357C＞T和250G＞A），其中357C＞T不改變氨基酸，為多態現象；250G＞A雖然引起V84I氨基酸改變。但是李慶忠等［16］認為Cx31這種雜合突變不是導致患者耳聾的惟一原因，可能存在沒有檢測到的其他因素，單獨或者與Cx31共同作用導致這些患者聽力下降。Kelsell等［17］在一個Cx26基因突變引起的NSHI家系中篩查到Cx31基因突變，因而推測Cx26基因與Cx31基因可能有協同及交叉作用。

1.3 GJB6編碼連接蛋白30（Connexin30，Cx 30） 人類GJB6基因于1999年被克隆，定位于13q11-q12.1。它與GJB2具有77%的序列同源性，但GJB6在C末端比GJB2多37個氨基酸。人類GJB6基因DNA全長9 544 bp，被2個內含子分成2個非編碼的上游外顯子和一個較大的含有完整編碼序列的第3外顯子。GJB6在多種組織器官表達，如內耳、皮膚、腦部、眼睛、膀胱、結腸、胃、胰腺、前列腺、子宮和睪丸等。高度的核苷酸、氨基酸序列同源性，毗鄰的基因定位決定了GJB6和GJB2近似一致的基因表達分布，它們共同表達于外胚層來源的組織中，特別是在人類的耳蝸和皮膚組織［18］。雙重免疫組織化學染色提示大鼠耳蝸中Cx30與Cx26在耳蝸上皮間隙連接系統、結締組織細胞間隙連接系統均有表達。Cx30與Cx26可以在細胞膜上形成異型縫隙連接，作為一個整體在內耳K+調控中發揮作用［19］。在NSHI耳聾中GJB6最常見的突變是342 kb的大片段缺失 del（GJB6-D13S1830）、del（GJB6-D13S1830）純合缺失或與GJB2單等位基因突變共存的雜合缺失，從而導致感音神經性聾。在歐美一些國家中del（GJB6-D13S1830）是非綜合征耳聾的第2位常見原因，在攜帶GJB2單等位基因突變的患者中占有較高比例，鑒于delGJB6-D13S1830）在單個GJB2等位基因突變患者中的較高比例，美國和意大利學者建議將del（GJB6-D13S1830）列為非綜合征感音神經性聾的常規檢測項目。在中國，韓東一等［20］在2006年對215例SNHL患者進行了GJB6基因檢測。袁永一等［21，22］分別在2007年檢測了372例非綜合征遺傳性聾患者，2008年檢測了19例GJB2單等位基因突變的耳聾患者，均未發現del（GJB6-D13S1830），僅在其中1例發現攜帶GJB6基因點突變404C＞A，導致了氨基酸的錯義改變T135K。物種間Cx30氨基酸序列進化分析證實該點位于Cx30高度保守的第3跨膜區。他們均認為GJB6基因突變在中國耳聾人群中整體發生頻率較低，GJB6基因可暫不列為第一線耳聾基因檢測項目。

1.4 SLC26A4 1999年，Usami等［23］把前庭水管擴大伴感音神經性聾的非綜合征型聾的基因定位在7q31，與Pendred綜合征的致病基因相同，即SLC26A4，又名 PDS基因。Usami等認為，SLC26A4基因突變可引起綜合征或非綜合征型感音神經性耳聾，大前庭水管綜合征為非綜合征型的。SLC26A4基因定位于7q31，全長4 930 bp，含有21個外顯子，開放閱讀框2 343 bp，編碼的蛋白Pendrin屬于硫酸鹽轉運子家族，在內耳主要表達于內淋巴管、內淋巴囊、橢圓囊和球囊斑相連的非感覺上皮以及外溝的外側壁，介導氯離子的轉運，維持內淋巴液的離子平衡［24］。目前的研究顯示，SLC26A4基因在非綜合征型耳聾人群中的檢測頻率和主要突變方式表現出了明顯的種族特異性和地域特異性。在北歐高加索人種中最常見的2個突變為T416P和IVS8+1G＞A［25］，在東亞的蒙古人種中，日本和韓國的SLC26A4基因的主要突變方式為 H723R［26］。在中國，Wang等［27］對107例中國前庭水管擴大患者進行了SLC26A4基因21個外顯子測序，發現位于第7外顯子的IVS7-2A＞G和第19外顯子的H723R是中國人群的熱點突變，二者在所有突變中分別占57.63%和9.04%。Wu等［28］對中國臺灣的38個前庭水管擴大或Mondini畸形患者家庭進行SLC26A4基因突變的篩查，結果顯示IVS7-2A＞G占所有突變的84%。郭玉芬等［10］在中國西北地區的801例NSHI患者中進行第7外顯子和第19外顯子的檢測，結果顯示，有98人攜帶SLC26A4基因IVS7-2A＞G和H723R突變，突變攜帶率為12.23%（98／801），其中 41人攜帶有SLC26A4基因雙等位突變位點（IVS7-2A＞G純合突變31例，H723R純合突變3例，復合雜合7例），突變頻率為5.12%（41／801）。IVS7-2A＞G位于外顯子8剪切位點的位置，即內含子7的3'末端距外顯子8起始位置的2個堿基處，突變后該位置的腺嘌呤被鳥嘌呤置換，使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8整個丟失，外顯子7和外顯子9直接相連，從而導致Pendrin的翻譯發生移框或提前終止，影響Pendrin的結構和功能［29］，使攜帶該突變的個體發生耳聾。

2 線粒體DNA

線粒體是細胞氧化磷酸化的中心也是能量代謝的中心。線粒體DNA（mt DNA）是惟一存在于人細胞質中的DNA分子，是獨立于細胞核染色體外的基因組。mt DNA不與組蛋白結合，修復能力低下，容易發生堿基突變，具有自我復制、轉錄和編碼功能，但同時受到核DNA的調控。除了極個別的例子外，mtDNA顯示了嚴格的母系遺傳規律。正常情況下，大多數健康個體不同的細胞或組織中的mtDNA都是同一類型的，即均質性（homoplasmy），但在許多線粒體疾病中線粒體發生突變，在這種情況下可能出現細胞中突變型mtDNA和野生型mt DNA 共存，即異質性［30］（heterplasmy）。異質細胞分裂時，突變的mt DNA隨機分布到子細胞中，經過多代的傳遞，mt DNA表型向突變型mt DNA占優勢的方向漂變。當突變積累過多時，能量輸出會降低到正常細胞、組織和器官功能維持最低需要量以下，就會出現癥狀，并越來越嚴重。Sinnathuray［31］認為3%以上的感音神經性耳聾患者中存在線粒體基因突變。線粒體DNA突變與氨基糖甙類藥物致聾 （Aminoglycoside Antibiotic-Induced Deafness，AAID）和非綜合征型耳聾有關。近年來國內逐步開展了mt DNA突變的檢測，并發現了多種突變類型。

2.1 線粒體DNA A1555G突變 1991年中國學者邱維勤分析了36個氨基糖甙類抗生素致聾家系的遺傳圖譜，首次提出AAID為母系遺傳，即線粒體遺傳。1993年Prezant等［32］報道了3個中國家系的數個成員在使用氨基糖甙類抗生素后發生毒性耳聾，3個家系中均證實呈現母系遺傳的線粒體基因mtDNA 12Sr RNA的1555堿基A→G突變。隨后，非洲、西班牙、日本、蒙古、南美、以色列也有家系報道。在美國，帶有A1555G突變的耳聾患者占全部氨基糖甙類抗生素引起耳聾患者的15%，說明這一突變在人群中的較高發生率。袁慧君等［33］對3個有明確氨基糖甙類藥物應用史的母系遺傳家系的研究發現，A1555G突變并非氨基糖甙類抗生素易感的惟一分子學機制。王力紅等［34］調查我國西南地區氨基糖甙類抗生素藥物性耳聾時，發現患者中約30%有母系遺傳家族史，線粒體DNA A1555G突變有較高檢出率，是影響藥物易感性的重要因素。戴樸等［9］檢測了全國18個省的2 016例非綜合征型耳聾病例線粒體DNA 12Sr RNA A1555G突變，全國平均檢出率為2.83%。攜帶線粒體A1555G突變者還可以在沒有使用氨基糖甙類抗生素的條件下出現耳聾，也就是說氨基糖甙類抗生素是影響這種基因突變的表現型的1個外在因素，由于線粒體A1555G的突變，使得人類的線粒體12Sr RNA的結構更像細菌的r RNA，從而對氨基糖甙類抗生素表現出敏感性。

2.2 線粒體DNA C1494T突變 2004年，Zhao等［35］報道了一個與AAID及非綜合征型聾有關的mt DNA C1494T突變的大家系，讓人類對線粒體DNA突變與耳聾的研究進展又進了一步。在沒有使用氨基糖甙類抗生素時，這個家庭中的一些母系親屬表現出遲發型／進行性耳聾，其發病年齡和嚴重性也表現出很大的不同。王秋菊等［36］在兩個母系遺傳性耳聾家系中共發現了18名線粒體12Sr RNA C1494T突變成員，這些攜帶者中有13名發生了耳聾，在發生耳聾的患者中，除1名患者在3歲時肌注1支奎寧后出現重度耳聾，3名患者缺乏明確的用藥史以外，其余9名耳聾患者均有明確的氨基糖甙類抗生素應用史，結果顯示兩個家系成員的耳聾與氨基糖甙類抗生素的應用密切相關。mt DNA C1494T突變位于mt DNA 12Sr RNA的小核糖體亞單位的編碼區域，其序列從細菌到哺乳動物是高度保守的。當發生C1494T突變時，可以形成新的1494U-A1555堿基配對，這和12Sr RNA的A1555G突變造成的1494C-G1555堿基配對在結構上相似［35］。研究表明：由C1494T或A1555G突變所形成新的U-A或G-C堿基配對使得這個r RNA解碼區的二級結構與大腸桿菌的16SRNA的相應區域更加相似，因而這個突變實際上使線粒體DNA與氨基糖甙類藥物的結合更加容易［37］，而臨床研究也發現攜帶這些突變的個體接受氨基糖甙類藥物后，可以造成聽力下降或原有的聽力下降程度加重［35］。

2.3 線粒體DNA 961位C插入突變 Bacino等［38］報道的線粒體12Sr RNA 基因 961del T／insC（n）以及該基因中2個同質性的突變也可引起氨基糖甙類耳聾的易感性。Li等［39］對線粒體12Sr RNA進行了系統的突變分析，研究對象為中國散發的氨基糖甙類藥物性聾和非綜合征型耳聾的兒童。他們發現，在這一人群中48%為氨基糖甙類藥物性耳聾；961位點的突變分別占氨基糖甙類藥物性耳聾和非綜合征耳聾病例的1.7%和4.4%；A1555G分別占13%和2.9%。曹新等［40］對一個6代507人中的137人耳聾的大家系致病基因定位研究，結果發現所有母系成員均存在mt DNA 12Sr RNA基因的A1555G及961insC雙重同質性點突變，而在同時進行研究的2例非母系親屬及l例散發患者中未見這2個位點的改變。提示線粒體12Sr RNA基因區域A1555G和961insC的雙重突變可能共同參與了AAID聽力損害過程。但近年來文獻［41，42］不支持 mtDNA 961del T／insC（n）突變是藥物性耳聾的遺傳基礎的觀點。李建忠等［43］在中國1個耳聾家系的所有9例母系成員中均檢出mtDNA 961del T／insC（n）突變，有明確氨基糖甙類抗生素用藥史的4例中只有2例耳聾患者，其中1例為用藥之前出現的先天性聾，另1例為用藥后38年出現的輕度耳聾，突變不與耳聾共分離。該研究不支持mt DNA 961del T／insC（n）突變是該家系耳聾的致病突變，認為mt DNA 961位點附近可能是1個多變異的區域，mt DNA 961del T／insC（n）可能是1個與氨基糖甙類藥物性耳聾不明確相關的多態。

2.4 線粒體DNA T1095C突變 T1095位點位于12Sr RNA的第25個螺旋上，該RNA的P位在許多物種中都高度保守，這個位點在線粒體蛋白質合成的起始過程中很關鍵［44］。1095位點T到C的轉換打破了12Sr RNA第25螺旋莖桿結構中1個進化上保守的堿基對A-U［45］，明顯地改變了這個保守區域的二級結構。這一突變曾經在意大利的1個患有聽神經病、氨基糖甙類抗生素耳聾和帕金森病的家系中發現［44］。在另外1個有母系遺傳聽力損失的意大利家系和1個有聽神經病的中國患者的mt DNA中也發現1095 T＞C的突變。1095 T＞C突變在這些遺傳上不相關但都存在聽力損失的患者中出現，強烈提示其可能參與了聽力損失的發病過程。Thyagarajan等［44］對攜帶1095 T＞C突變的細胞系的呼吸鏈功能進行研究，發現該細胞系的氧化磷酸化復合體IV的活性大約是正常人的一半，而復合體II的活性也較正常的細胞系有所降低。Zhao等［46］推測1095 T＞C進一步導致12Sr RNA的三級或四級結構發生改變，可能會影響線粒體的蛋白質合成功能，因此導致線粒體功能障礙和耳聾。袁永一等［47］檢測134例NSHI患者發現3例1095 T＞C突變并在75例聽力正常的人群中也發現1例攜帶1095 T＞C突變，提示mtDNA 1095 T＞C突變可能與1555 A＞G突變一樣屬于條件致病突變。

2.5 其他線粒體基因突變 有報道顯示與非綜合型耳聾相關的mt DNA點突變還有位于t RNASer（UCN）基因上的 A7445G、A7445C、G7444A、7472insC、T7510C 和 T7511C 突 變［48-53］。其 中，G7444A突變發生于沒有A1555G突變的耳聾病例，但隨后的研究發現在遺傳性耳聾患者中可同時存在線粒體DNA A1555G突變與G7444A突變，進一步的研究提示G7444A突變致聾機理與A7445G突變相似［54］。徐延軍等［55］認為 G7444A突變可能共同參與了A1555G聽力損害的過程，但尚缺乏G7444A突變單獨存在導致耳聾的證據。劉玉和等［56］對128例NSHI家系成員和133例NSHI患者進行了A7445G突變檢測，均未發現突變。Zhiyuan Li等［57］報道線粒體12Sr RNA 基因的A827G、T1005C和A1116G突變可能參與AAID的發病。這些線粒體基因突變在AAID中是否與線粒體A1555G有協同作用或單獨起作用，目前研究較少，有待進一步研究總結。

2.6 致病機制 關于氨基糖甙類抗生素耳毒性的發生機制，管敏鑫等［58］認為氨基糖甙類抗生素敏感的位點在線粒體核糖體內。氨基糖甙類抗生素先進入耳蝸和前庭，然后積累起來。這種藥物通過與12S r RNA特別是那些有A1555G突變或者C1494T突變的線粒體的相互作用，而抑制線粒體蛋白合成，這些線粒體的翻譯缺陷導致耳蝸和前庭細胞內ATP的產量下降。同時，這些氧化磷酸化的缺陷導致大量活性氧（ROS）的產生，因而損傷線粒體和細胞內的蛋白、脂類和核酸。結果，線粒體的通透性轉運孔道開放并啟動細胞死亡途徑，這將導致耳蝸和前庭細胞功能的喪失或細胞死亡并出現聽力損失。

線粒體A1555G突變是造成耳聾發生的一個主要因素，但是它自身并不足以引起耳聾的表型，其他一些修飾因子，如氨基糖甙類藥物或者核修飾基因，調節了A1555G或C1494T的表型顯示［59］。在線粒體中可能還有尚未發現的突變位點，通過與核修飾基因在結構和功能上相互作用，達到影響線粒體突變表型的顯示。

展望

非綜合征性耳聾相關基因的深入研究對耳聾的病因學認識、診斷和治療已經形成了積極的影響。隨著對大量耳聾基因的了解，人類已經開始把研究成果應用于臨床工作，在許多國家都已經開展了耳聾基因檢測。2004年意大利人Coviello［60］對5 449例妊娠3個月的孕婦做了產前染色體和DNA檢測，其中2 997人接受了35delG基因突變檢查，有67人證實為突變攜帶者，此項研究表明了產前基因檢測和咨詢是可行的。因遺傳性耳聾在全世界范圍都有很高的發生率，故基因診斷及治療工作有著極其重要的意義。在中國也開始了耳聾基因篩查工作，戴樸［9］在2006年進行了全國范圍的NSNI流行病學調查檢測了GJB2 235delC和線粒體DNA 12Sr RNA A1555G 基因。李麗［61］在 2009 年對1 234例新生兒進行了聽力與聾病易感基因mt DNAA1555G、GJB2和SLC26A4的聯合篩查，基因篩查未通過者32例，其中2例為mtDNA A1555G突變陽性，GJB2基因235delC雜合突變20例，SLC26A4基因IVS7-2A＞G雜合突變10例，耳聾基因陽性率26‰（32／1234）。對這些基因篩查結果的分析與后期的干預，不僅能預防受篩查本人聽力損失，而且也可以鎖定一些聾病高危人群，給他們預警，防止聾病的發生，或是通過遺傳學咨詢避免聾病基因的繼續下傳。我國具有豐富的耳聾基因資源，可以開展大規模基因突變篩查，有可能發現中國人特有的耳聾相關基因或突變類型，并且全國不同地區各種耳聾基因的致病率，各種耳聾基因的突變的頻率和分布，特定耳聾基因分布和多態性均不同。

迄今為止，在耳聾基因的發現及診斷方面已有了階段性的成果，還遠不能解釋臨床中出現的各種耳聾表型特征出現的原因，而且很大一部分還限于實驗室階段，檢測手段尚待完善，簡便、可靠、經濟并能夠提供給臨床應用的基因檢測及治療方法還有待進一步研究及改進。隨著人類后基因組時代的到來，基因敲除、蛋白質組學的發展及各種蛋白相互作用機制的發現將加速致病基因的功能研究。總之，對耳聾發生機制，發展的分子水平變化過程的認識，最終將為耳聾疾病進行早期診斷、遺傳咨詢、預防和治療提供理論基礎。

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